研究背景：青光眼滤过手术是目前治疗青光眼最重要的方法，但是手术失败的主要原因是手术后滤过泡的瘢痕纤维化。临床上往往术中使用5-氟尿嘧啶(5-FU)、丝裂霉素(MMC)等抗代谢药物来抑制术后滤过泡的疤痕形成，以提高手术成功率，但仍然有诸如滤过泡渗漏、低眼压、眼内炎、角膜损伤等并发症的发生。因此，寻求一种更为安全、有效、毒性小的药物作用于抗青光眼术后抑制瘢痕形成是目前的研究热点。滤过泡的瘢痕化与多种致纤维化因子的活性密切相关，其中转化生长因子-β(transforming growthfactor-β，TGF-β)的作用至关重要，其亚型TGF-β2在眼部瘢痕疾病的发生中起主要作用。TGF-β与其Ⅱ型受体(TGF-β receptorⅡ，TβRⅡ)结合作为致组织纤维化的启动环节中的关键步骤，促使成纤维细胞转分化为具有收缩功能的肌成纤维细胞，合成大量的细胞外基质，在组织瘢痕化的发生中起至关重要的作用。因此，通过拮抗或者封阻TGF-β与TβRⅡ的结合，可以作为青光眼术后抗瘢痕治疗新的研究途径。本课题组在前期的研究中使用SELEX技术筛选得到了靶向TβRⅡ胞外段的核酸适配子S58，并在体外实验中验证S58能有效抑制人成纤维细胞α-SMA表达，且能明显阻抑TGF-β2介导的成纤维细胞转分化、细胞收缩作用。初步筛选出来的核酸适配子一般作为先导分子，需要进一步进行结构优化或者基团修饰，寻找到能发挥功能的最佳序列。大多数适配子的两端序列是固定侧翼序列，对其功能影响较微弱，核酸适配子S58是含60个左右碱基的核酸，其合成成本较高，因此本研究将S58进行结构优化，分别从两端逐步剪切缩短序列，去掉冗余的序列，得出新的较短适配子DNA，并在体外分别验证核酸适配子58及优化后ssDNA的结合力情况，从细胞水平验证其生物学效应，从中筛选出发挥最佳效果的最短适配子序列，为青光眼术后抗瘢痕治疗寻找到新的替代药物，并为下一步药效动力学实验及体内实验提供的理论基础。适配子能发挥作用是基于其能识别靶分子上不同的基团，并自身发生适应性结构改变使其能与靶分子紧密结合形成稳定的空间结构，故常常具有与抗体相似甚至更高的亲和力、特异性。因此研究适配子的作用机制重点在于研究其空间结构及与靶分子的结合位点。伴随分子生物学和信息科学飞速的发展，利用生物信息学方法探索蛋白质与核酸相互作用能提高其有效性，缩短研究工作的时间，达到事半功倍的效果，生物信息学已经成为研究生物领域课题的一项指导科学。因此运用生物信息学方法建立筛选出的最佳核酸适配子的三维模型，研究其与受体蛋白的结合位点是尤为必要并且可行的，旨在初步探索最佳核酸适配子发挥体外生物高效应的作用机理。目的：本研究拟将根据靶向TβR胞外段核酸适配子S58序列进行剪切缩短，合成新的较短适配子DNA，并在体外进行其结合力、生物学效应的验证研究，筛选出发挥最佳生物功能的适配子，为抗青光眼术后抗瘢痕治疗提供新的思路。进一步运用生物信息学建立适配子的三维模型，并预测其与受体蛋白的结合位点，对最佳适配子发挥体外作用的机理进行初步研究。方法：1.激光共聚焦显微镜观察核酸适配子S58与成纤维细胞的结合情况，根据核酸适配子S58序列从两端逐步剪切缩短，每次剪切掉5bp，得到7个新的较短适配子ssDNA，运用生物传感器芯片包被受体蛋白后分别检测核酸适配子S58及结构优化后的ssDNA的亲和力大小。流式细胞仪技术检测荧光标记后的核酸适配子S58及结构优化后的ssDNA与HTFs的结合率情况。从而筛选出结合力最强的适配子。2.核酸适配子S58及结构优化后的ssDNA与TGF-β一同作用于HTFs24小时后运用蛋白质印迹法检测细胞的α-SMA的表达量，核酸适配子S58及结构优化后的ssDNA与TGF-β共同作用48h后检查成纤维细胞凝胶的收缩情况。从而筛选出体外生物学效应最佳的适配子。3.通过核酸适配子序列转录为RNA序列，运用软件建立其RNA的三维模型，再转换为ssDNA的三维模型，Protein Data Bank(PDB)数据库搜索到受体蛋白TβRII胞外段的晶体结构，比对确认最有可能在溶液中与适配子结合的三维晶体结构，然后对DNA分子和蛋白质分子进行半柔性分子对接实验，统计聚类分析核酸适配子的结合情况，根据函数打分及经验选择出最可靠的核酸适配子与受体胞外段蛋白的复合物模型，运用软件准确分析其结合位点。结果：1.激光共聚焦显微镜下能够观察到5’端标记的FITC-S58荧光显示与HTFs排列形态一致；在相同浓度下，S58与TβRⅡ的结合反应峰值维持在350arc/s，其次为S583’端剪切5bp结合反应峰值达200arc/s，S583’端剪切10bp结合反应峰值达160arc/s，S583’端剪切15bp仅为130arc/s，S585’端剪切的结合反应峰值均仅达80~120arc/s。相同浓度为5nmol/L时，FITC-58与HTFs的结合率为72.9%，而5’端剪切的ssDNAS58-1~4的细胞结合率分别为：39.0%、27.6%、23.5%、22.3%，3’端剪切的ssDNAS58-5~7的细胞结合率分别为：41.4%、38.7%、23.9%。2. Western Blot结果显示所有剪切缩短的ssDNA组中只有TGF-β2+S583’-5bp组较TGF-β2组α-SMA表达有明显降低(P=0.000)，但其降低程度仍比TGF-β2+S58组低，其他组与TGF-β2组比较α-SMA表达均无差异(P>0.05)。细胞收缩实验中TGF-β2组刺激后HTFs收缩后是原面积的11.6%，TGF-β2+S58组刺激后HTFs收缩后是原面积的63.2%，与TGF-β2组相比具有统计学差异(P <0.05)，而TGF-β2+S585’-5bp组及TGF-β2+S583’-5bp组刺激后HTFs收缩后是原面积的9.7%、10.4%，与TGF-β2组相比无统计学差异(P>0.05)。3. TβRII胞外段蛋白由122个氨基酸组成，有10种自然态结构，并且是以二聚体结构存在，最有可能在溶液中与适配子结合的三维晶体结构是1PLO-3。核酸适配子S58是60个碱基的寡核苷酸，形成三维结构时发生自身适应性互补形成局部双螺旋结构，聚类分析找出DNA与受体蛋白的结合面。根据对接后函数打分找到最可能的复合物模型，再分析其结合位点分别包括位点I(T4、T5、G6、C7)、位点II(G13、A14、T15、C16、G17、C18)、位点III(T31、G32、T33、C34)及位点IV(G40、A41、T42、T43、T44、G45、G46号)。结论：1.剪切后的ssDNA中S58-5即S583’端剪切5bp与TβRⅡ结合力最强，但仍较S58降低。同样剪切后的ssDNA与HTFs的结合率也较S58降低。因此，核酸适配子S58的结合力仍是最佳的，5’端及3’端剪切后得到的新ssDNA结合力均较S58均下降，并且剪切碱基越多，结合力越低。2.体外核酸适配子S58能抑制TGF-β2诱导的HTFs转分化、收缩作用，剪切缩短后的ssDNA中只有S583’端剪切5bp对TGF-β2诱导的HTFs转分化有一定抑制作用，但作用比S58弱，其他缩短后的ssDNA均无明显作用，并且剪切碱基越多，作用越弱。因此核酸适配子S58的生物学效应仍是最佳的，5’端及3’端剪切都会影响其生物功能。3.核酸适配子S58与TβRⅡ胞外段的结合位点较紧密。5’端剪切5bp就会剪切掉结合位点I(T4、T5、G6、C7)中的T4，同样，5’端剪切10bp、15bp、20bp还影响到位点II(G13、A14、T15、C16、G17、C18)，因此5’端剪切会显著影响适配子的生物功能。3’端剪切5bp未剪切到关键结合位点，但体外作用仍然降低，因为核酸适配子S58具有一定的结构稳定性，3’端剪切后影响S58在溶液中局部的构象，仍然会影响其与TβRⅡ胞外段的结合，从而影响其发挥体外作用。生物信息学从理论上预测DNA与蛋白质的相互作用是快速有效便利的方法，初步地探索了S58发挥体外作用的机理，但具体作用机制还需进一步实验验证。