论文部分内容阅读
研究背景及目的肌腱病在运动医学领域比较常见,普遍认为各种不恰当运动致肌腱过度重复使用,肌腱出现微小的撕裂损伤,造成肌腱组织逐渐变性和退变,但其发病机制目前尚不十分清楚。相关研究发现:人肌腱细胞在体外牵伸载荷条件下产生的前列腺素E2(ProstaglandinE2,PGE2)明显增高,过度运动锻炼后肌腱腱鞘周围PGE2水平也明显增加,提示过度的机械载荷下肌腱细胞和其周围结缔组织产生的PGE2有可能在肌腱病发生发展过程中起着重要作用。正常肌腱组织富含胶原蛋白,主要是Ⅰ型胶原,以及少量的III型胶原,肌腱病组织主要是胶原基质发生了改变,胶原纤维束连续性中断,结构松散、裂隙。退行性病变肌腱及负荷大的肌腱止点处III型胶原增多,肌腱病的动物模型的在体研究发现肌腱的胶原总量有显著降低,III型胶原增高,在体外培养条件下肌腱细胞随传代次数的增加,肌腱增殖能力有较大降低,Ⅰ型胶原分泌减少,I/III型胶原比例倒置。在各种造成肌腱损伤因素下,肌腱胶原基质发生重塑,胶原类型发生转变,并逐渐积累基质恶化。PGE2是否能导致肌腱细胞、胞外胶原基质和生物力学的改变尚缺乏直接证据。为此,我们从肌腱病组织临床病理学研究着手,观察肌腱病组织病理学特征,分析外源性PGE2对肌腱细胞增殖及I、III型胶原蛋白分泌的影响,探明对肌腱组织中胶原类型、胶原含量及生物力学等影响,初步探讨PGE2与肌腱病之间的关系。方法:1.人肌腱病组织的组织病理学观察临床收集肌腱病手术治疗中切除的病变肌腱组织和因外伤、截肢等手术中废弃的正常肌腱组织,H-E染色比较观察肌腱细胞结构、肌腱基质形态,苦味酸-天狼星红染色在偏光显微镜下比较观察肌腱胶原基质变化,分析胶原含量和胶原类型的变化。2.不同剂量外源性PGE2对体外人肌腱细胞增殖及胞外基质胶原的影响使用组织块法和酶消化法分离人肌腱原代细胞,进行培养与传代,镜下观察细胞形态,I、III型胶原免疫荧光染色法鉴定肌腱细胞;将肌腱细胞按1X10~4数量级接种96孔培养皿中,分别加入不同剂量PGE2共培养12h、24h、48h,应用[3H]-TdR掺入法通过闪烁计数测量肌腱细胞的增殖情况;应用I、III型胶原酶联免疫检测不同剂量PGE2作用肌腱细胞后培养液中I、III型胶原蛋白分泌量。3.外源性的PGE2对兔跟腱胶原含量、比例及生物力学特性的影响将健康日本短耳兔根据PGE2注射剂量的不同随机分两组,即50ng组和500ng组,每组动物随机选择一侧后肢跟腱作为实验侧,对应的另一侧为对照侧,实验侧跟腱注射PGE2,对照侧跟腱注射等量生理盐水,注射方式为经皮注射,注射部位为跟腱中部,注射量为0.2ml,每周注射一次,4周和8周后分别处死两组实验动物,收获兔跟腱标本,观察大体情况,取标本进行固定包埋切片H-E染色,镜下观察组织结构、基质形态,天狼星红染色在偏光显微镜下观察组织中胶原成分的变化并应用图像分析软件定量分析I、III型胶原含量,制备电镜标本在透射电镜下观测胶原纤维的密度和纤维直径的变化。另取注射8周后标本,应用微机控制电子万能测试机对跟腱进行力学测试,比较实验侧和对照侧跟腱的最大载荷、抗拉强度的变化,比较高、低剂量两组实验侧跟腱的最大载荷、抗拉强度的变化。结果:1.与正常肌腱组织比较,肌腱病组织HE染色显示肌腱组织胶原纤维排列紊乱,结构明显破坏,天狼星红组织染色示肌腱组织中黄红色的Ⅰ型胶原纤维明显减少,绿黑色的Ⅲ型胶原纤维明显增多,整个胶原基质排列杂乱无章,失去正常肌腱组织结构。2.两种方法均能分离培养出人原代肌腱细胞,且传代培养生长良好。加入PGE2培养48h时,小剂量的PGE2能促进细胞增殖(P<0.05),培养24h和12h时,小剂量PGE2对肌腱细胞增殖影响不明显(P>0.05);随着PGE2剂量增大,能抑制肌腱细胞增殖(P<0.05)。应用ELISA技术检测细胞培养液中胶原蛋白分泌情况显示,不同剂量PGE2作用下肌腱细胞Ⅰ型胶原的分泌增加不明显(P>0.05),Ⅲ型胶原分泌增加明显(P<0.05),Col III/Col I的比值增大(P<0.05)。3. PGE2注射实验侧跟腱出现同人肌腱病组织类似的表现,即不同程度表面血管化,与腱鞘粘连,弹性差,局部呈灰黄色。与对照侧比较,HE染色显示两组实验侧跟腱组织中胶原纤维的结构均破坏,凌乱、松弛、欠规整、纤维断裂;天狼星红-苦味酸染色显示实验侧Ⅲ型胶原纤维大量增加,排列紊乱,Ⅰ型胶原明显减少,胶原纤维明显变细,定量分析显示实验侧肌腱内I型胶原含量明显低于对照侧(P<0.05),Ⅲ型胶原含量显著高于对照侧(P<0.05),Ⅲ型/Ⅰ型高于对照侧(P<0.05)。高剂量组与低剂量组对比发现:两组对照侧无明显差异,高剂量组实验侧Ⅲ型胶原纤维增加,Ⅰ型胶原纤维减少,Ⅲ型/Ⅰ型的比值增高(P<0.05)。注射8周与4周对比发现,两组8周实验侧I、Ⅲ型胶原的含量均有变化,但无统计学差异(P>0.05)。电镜下观察,实验侧肌腱单位面积内胶原纤维密度降低,直径粗大的纤维比例降低,直径细小的纤维比例增加(P<0.05);两组实验侧对比发现,高剂量组胶原纤维密度和直径粗大纤维比例更低,直径细小纤维比例更高(P <0.05)。力学实验结果示:8周后两组中实验侧跟腱最大载荷和抗拉强度均较对照侧降低(P<0.05),高剂量组与低剂量组对比发现:实验侧跟腱最大载荷和抗拉强度降低(P<0.05)。结论:1.肌腱病组织病理学观察发现人肌腱胶原基质发生了明显变化,胶原基质退变、变性,纤维结构破坏;胶原的类型发生变化,即I型胶原减少,III型胶原增多;2.外源性PGE2作用条件下影响人肌腱细胞增殖和Ⅰ、Ⅲ型胶原的分泌情况,小剂量能促进细胞增殖或影响不明显,随着PGE2剂量增大能抑制细胞增殖;不同剂量PGE2均能使肌腱细胞分泌Ⅲ型胶原蛋白增多,使III/I型胶原比例倒置。3.重复暴露PGE2能导致肌腱胶原基质改变,局部组织裂解,纤维松散,I型胶原降低,III型胶原增加,单位面积内胶原纤维密度降低,直径变细,生物力学性能降低,和肌腱病组织病理学特征一致。