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枇杷(Eriobotrya japonica Lindl.)原产于我国,其栽培历史悠久,是我国亚热带地区的珍稀特产水果,具有较高的经济价值。浙江和江苏是我国著名的枇杷主产区,拥有丰富的枇杷种质资源,也属于高度进化枇杷类型栽培区。因此,以当地枇杷主栽品种或类型为主,开展我国主要枇杷品种的遗传多样性和亲缘关系研究,对枇杷种质资源的有效保护和创新利用具有重要的指导意义。
本论文以收集到的浙江和江苏主栽枇杷品种或类型为主,结合福建和四川主栽品种,以及栎叶枇杷和大渡河枇杷共54个品种或类型为试材。选取在苹果和枇杷遗传连锁图谱上已定位的110个苹果SSR标记,筛选可用于枇杷遗传分析的SSR引物,建立枇杷SSR标记体系,对54个供试材料进行遗传多样性分析和品种鉴别,并对大五星天然三倍体枇杷株系的遗传多样性进行了研究,筛选可用于天然三倍体枇杷鉴定的SSR标记,主要结果如下:
1、建立了枇杷SSR反应体系,利用‘鸡蛋红’、‘夹脚’、‘长红’、‘铜皮’、‘大五星’、‘早黄’、‘大红袍’和‘大玫瑰红袍’8个品种,从110对SSR引物中筛选出在8个枇杷品种中具有多态性的引物78对,多态性引物比率为71％,通过梯度PCR分析,筛选出78对引物的适宜退火温度。
2、利用39对SSR引物对54个供试材料进行遗传多样性分析,共扩增出155个等位基因。AT000400-SSR、CH01h02、CH03c02和CH01d03四对引物为多基因座引物,不用于遗传多样性分析。在不统计大渡河枇杷和栎叶枇杷等位基因的情况下,各引物52个栽培枇杷的等位基因数为2-7个,平均每对引物扩增出3.38个等位基因。有效等位基因数最高的是引物CH03a09,有4.01个等位基因,CH01f02有效等位基因数最少,为1.04,35对引物的平均有效等位基因数为2.21。香农指数最小的是CH01f02,为0.10,CH03a09最高,为1.49,平均香农指数为0.84。观察杂合度为0-0.83,CH01f02最低,Hi08a04最高,平均为0.47;期望杂合度最高的是CH03a09和CH02d12,均为0.76;CH04f02最低,为0.04；平均期望杂合度为0.50。固定指数从Hi08a04的-0.71到CH01f02的1.00,平均为0.07,表明供试枇杷种质间具有丰富的遗传多样性。对供试材料进行UPGMA聚类分析,以SM相似性系数0.48为阀值,将供试材料分成栽培枇杷和野生枇杷两组。栽培枇杷以0.723的SM相似性系数为阀值,可分成A、B和C三个亚组。A亚组包括所有浙江和江苏地方类型,地理来源很近,属温带类型,来自四川的‘龙泉1号’、福建的‘长红’以及西班牙的两个品种‘Marc’和‘Peluches’也聚在A亚组内。B亚组主要是福建品种‘早钟6号’、‘解放钟’、‘香钟’、‘太城4号’和‘白梨’,属于亚热带品种,日本品种‘森尾早生’作为早钟6号的亲本之一,也聚在该亚组；此外,四川栽培品种‘金丰’也聚在B亚组内。C亚组仅由四川栽培品种‘大五星’组成。主成分分析结果与UPGMA聚类分析结果基本一致,两个野生枇杷类型与栽培枇杷类型明显区分开,栽培类型主要根据其地理分布分成4组,第Ⅰ组包括所有浙江类型和10个江苏类型,日本枇杷品种‘森尾早生’及西班牙品种‘Marc’、‘Peluches’；第Ⅱ组包含15个江苏枇杷类型；第Ⅲ组由6个福建枇杷品种组成；四川主栽品种‘大五星’和‘龙泉1号’组成第Ⅳ组。39对多态性SSR引物可区分‘Marc’与‘Peluches’两个西班牙品种及‘美玉’与‘常绿2号’两个江苏品种和类型外的所有供试枇杷类型。SSR基因型分析结果验证了‘早钟6号’(解放钟×森尾早生)、‘常绿5号’(白玉×甜种)和‘香钟’的亲缘关系。本研究筛选到CH03a09、CH02c06、CH04g12、CH02d12和CH05h05五对引物组合可区分除‘Marc’与‘Peluches’、‘美玉’与‘常绿2号’外的所有供试材料3、从78对枇杷多态性SSR引物中,筛选出55对在大五星多倍体枇杷株系中有多态性的引物,用于10个株系的基因型分析结果显示,55对引物共扩增出135个等位基因,其中CH01h02-222 bp为大五星三倍体特有的等位基因。引物CH01h02在A332中扩增出222 bp、199 bp和195 bp三个等位基因；引物CH04c06在A332中扩增出214 bp、195 bp和185 bp三个等位基因,在A368和A379两个株系中扩增出217 bp、195 bp和185 bp三个等位基因；NZ02b01在株系A332中扩增出270 bp、266 bp和246 bp三个等位基因,引物Hi15h12在A322中扩增出238 bp、236 bp和230 bp三个等位基因。所有三倍体株系与二倍体相比,都出现了新的等位基因,表明供试的三倍体株系形成过程中可能都有外源基因的渗入。10个株系完全区分开,各株系间SM相似性系数最高的是A2x与A313,相似性系数为0.926;最低的是A313与A332,相似性系数为0.496。主成分分析将10个株系分成三组,第Ⅰ组包括A484.、A376、A379和.A368四个株系,A35、A322和A332三个株系构成了第Ⅱ组,第Ⅲ组由A2x、A313和A484三个株系组成,揭示SSR可用于天然枇杷三倍体的遗传多样性分析,并能鉴定部分三倍体株系。