Peroxidasins属于过氧化物酶环氧合酶家族成员,过氧化物酶环氧合酶家族出现在所有的生物体中,和chordata peroxidases(脊索动物过氧化物酶)及peroxinectins有密切的联系。Peroxidasins在生物体内是一个高度保守但具体功能未知的基因。Peroxidasins是多结构域基因,其全长包含一个信号肽、多个C型免疫球蛋白结构域(Ig)、多个富含亮氨酸重复结构域(LRR)、一个血红素过氧化物酶结构域(POX)及一个血管性血友病因子C模块结构域(VWC)。研究表明,Peroxidasins与昆虫血细胞和浆细胞的功能是有关联的,参与细胞外基质(ECM)、基底膜(BM)的生物合成,组织的发育和先天免疫防御等生命进程,并催化H2O2介导的酪氨酸和碘的氧化。目前,二化螟Peroxidasin的体内功能还不是很清楚,必须更全面地了解二化螟Peroxidasin基因的结构及功能特点,才能更深入的了解其在二化螟体内的作用方式及为其应用研究奠定基础。因此,研究Perxidasin基因对二化螟生长发育的影响及二化螟害虫治理新措施的开发都具有重大意义。本文克隆了二化螟Perxidasin基因的全长cDNA序列,采用荧光实时定量PCR对该基因的不同生长发育阶段与不同组织中的表达水平进行了分析,采用RNA干扰方法研究Peroxidasin基因被干扰后对高龄幼虫和预蛹的影响,Peroxidasin的真核表达与活性等研究,试图为Peroxidasin基因在二化螟体内的功能做出解释。1、二化螟Peroxidasin的结构特征通过克隆得到了该基因的全长,通过对该序列分析,发现二化螟Peroxidasin与家蚕Peroxidasin序列有高度的同源性。Peroxidasin包含为胞外分泌的信号肽、富含亮氨酸重复结构域(LRR)、C型免疫球蛋白结构域(Ig)以及血红素过氧化物酶结构域(POX)。通过结构域比较发现,在智人和果蝇Peroxidasin基因中含有血管性血友病因子C模块结构域(VWC),而在二化螟和家蚕Peroxidasin基因中,该结构域是缺失的。2、二化螟Peroxidasin基因的时空表达分析实验发现,Peroxidasin在二化螟各个发育期都有表达,从最高表达量的卵期开始随着发育龄期表达量总体趋势是下降的,到5龄达到幼虫期的最低水平表达量,之后6龄、蛹期的表达水平随之上升,并且雌蛹表达量高于雄蛹,羽化后的雌雄成虫的表达水平为产卵后高于产卵前;在4龄、5龄、6龄这三个幼虫龄期中,Peroxidasin的表达趋势为先从初期的较高水平下降到中期的较低水平,然后上升到末期的较高水平,这三个龄期的趋势大致相同。在6龄末期到预蛹阶段表达水平总体最高,化蛹后逐渐降低,直到成虫都是较低水平的表达。4龄幼虫分别在第16小时和第112小时左右有两个表达高峰,5龄幼虫在第48小时和第128小时左右有两个表达高峰,6龄幼虫在第72小时达到最高表达水平。6龄二化螟Peroxidasin基因在头部、表皮、马氏管、血淋吧、中肠都有较高的表达水平,尤其是头部最高,而脂肪体中的表达量均低于其他组织为最低表达量。3、二化螟Peroxidasin基因RNA干扰实验经过dsRNA处理的预蛹很明显地难以完成预蛹-蛹的变态过程。其主要出现三种表型变化,(1)预蛹在完成化蛹后,中部至尾部脱皮不干净,还有皮未脱离蛹体,并且观察这些蛹可以发现,其腹部发育畸形,蛹的整体形态不正常,后期观察这些畸形蛹成活率低,在蛹期死亡,无法羽化为成虫。(2)预蛹在化蛹过程中无法完成化蛹的变态过程,但是可以启动化蛹过程,预蛹身体出现红棕色的表皮,大部分身体区域出现蛹质化表皮,但其腹部不能蛹质化,保留原来预蛹阶段的旧表皮,并且其胸足还存在,体形更类似于预蛹阶段而非正常蛹的阶段,这种畸形预蛹最终也无法完成化蛹,而导致死亡。(3)预蛹完全不能化蛹,保持预蛹形态,虫体畸形,有尾部变黑,头部凸畸形现象出现,虫体有黑点,该畸形预蛹活力降低,最终保持该形态并死亡。实验中注射了 GFP的对照预蛹可以完成正常的化蛹程序,且蛹光滑完好,与正常蛹无异。这说明Peroxidasin在二化螟预蛹到蛹的变态过程中起到很重要的作用。4、Peroxidasin的真核表达与活性通过利用Bac-to-Bac昆虫杆状病毒表达系统在Sf9细胞系中成功地表达出二化螟Peroxidasin蛋白,并测定了其过氧化氢酶活性,其结果是显著高于对照组,这说明该表达系统表达的二化螟Peroxidasin蛋白是有活性的,具有过氧化物酶氧化过氧化氢的活性。这很可能与Peroxidasins含有动物过氧化物酶催化结构域(POX)相关的。综上所述,本实验通过对二化螟Peroxidasin基因的克隆、时空表达分析、RNA干扰后对幼虫的影响、二化螟Peroxidasin蛋白的获得及活性测定。说明二化螟Peroxidasin基因包含为胞外分泌的信号肽、冨含亮氨酸重复结构域(LRR)、C型免疫球蛋白结构域(Ig)以及血红素过氧化物酶结构域(POX);Peroxidasin在二化螟各个发育期和各个组织中都有表达,并是随着生育期是发展变化的;同时说明该基因对二化螟从预蛹到蛹的变态过程中具有重要的功能;Peroxidasin的真核表达实验说明该基因在体外的表达是成功的并且具有过氧化物酶的活性。