论文部分内容阅读
DNA甲基化是一种重要的表观遗传修饰,是基因组DNA可逆的分子标记,对基因印记、基因沉默、X染色体失活、细胞重编程、肿瘤发生等都起着重要的调控作用。UHRF1是一种可同时识别DNA甲基化和组蛋白修饰、并具有泛素化作用的多功能蛋白质,已被证明参与多种生物学调控的过程,如DNA甲基化的维持、细胞周期调控,尤其是在肿瘤的发生发展过程中起到不可忽视的作用。目前,已经证明UHRF1可以结合在异染色质区域,参与异染色质的形成,也可结合在常染色质区域,参与DNA甲基化的维持和基因表达的调控。那么,肿瘤细胞中异常高表达的UHRF1在染色体上的结合有无DNA序列特异性,UHRF1结合区域的DNA甲基化状态有无特征?针对上述问题,我们建立了研究染色体蛋白修饰与DNA甲基化和DNA序列关系的新方法—染色质免疫沉淀结合重亚硫酸氢盐测序技术(Chromatin Immunoprecipitation Followed by Bisulfite Sequencing, ChIP-BS-seq),将染色体免疫共沉淀技术与重亚硫酸氢盐测序技术相结合,在全基因组范围内检测同一个DNA分子上的染色体蛋白质结合和DNA甲基化水平。然后我们利用该技术直接探究UHRF1蛋白在染色体上结合序列的特征和DNA甲基化状态,再用ChIP-qPCR和重亚硫酸氢盐测序技术对结果进行验证。我们发现UHRF1结合的DNA80%位于重复序列区域,但在基因组中广泛分布,其ChIP富集峰(Peak)在3’UTR、外显子、启动子和重复序列的Observed/Expected值分别为1.7、2.2、1.4和1.6,说明UHRF1在细胞内优先结合在这些区域,其中位于基因区域的Peak占56.3%,覆盖923个基因；所有Peak中CpG内的C所占比例为1.01%,高于全基因组中CpG的频率,说明UHRF1倾向于结合在CpG二核苷酸处；但结合结构域序列分析显示除了重复序列以外,UHRF1没有结合的特征序列；3’UTR、外显子、启动子区域Peak的平均DNA甲基化水平均在0.7以上,说明UHRF1倾向于结合在DNA甲基化水平较高的位置；进一步分析发现与对照相比,UHRF1结合DNA序列的甲基化水平符合其维持DNA甲基化的功能推测；而且Peak与组蛋白修饰H3K9me3的谱式有较多重合。因此,我们利用ChIP-BS-seq技术第一次在肿瘤细胞内直接证明了UHRF1确实主要定位于重复序列,但也广泛分布在基因组中,结合没有序列特征,但倾向于结合高甲基化的DNA片段,并且参与重复序列和单拷贝基因DNA甲基化的维持和修复。本文的结果为进一步探究UHRF1在肿瘤细胞内的调控作用提供了更深入的信息,为UHRF1作为病人诊断和预后的生物标记提供了理论基础。