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目的探讨proBDNF封闭联合BDNF过表达对小鼠脊髓损伤修复的影响和作用机制,为寻找促进脊髓损伤修复新策略提供实验依据。方法1.构建BDNF过表达转基因小鼠：把BDNF cDNA插入系统性表达CMV启动子下游,构建BDNF转基因表达载体,显微注射法将转基因载体注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中,建立CMV-BDNF转基因小鼠。并利用特异引物PCR法鉴定转基因小鼠的基因型,RT-PCR及ELISA检测BDNF mRNA和蛋白表达水平,免疫组织化学检测该基因编码蛋白在脊髓组织中的细胞定位。2.建立脊髓横断小鼠模型,研究ProBDNF抗体封闭联合BDNF过表达对小鼠脊髓损伤修复的影响：成年健康雌性BDNF过表达转基因小鼠和野生型小鼠,体重18-25g,随机平均分成四组,依次是假手术组、脊髓横断(SCT)组、ProBDNF抗体封闭组、单纯BDNF过表达组、ProBDNF抗体封闭联合BDNF过表达组,每组12只。于T10水平横断小鼠脊髓,明胶海绵浸润抗体(抗体浓度为10ug/ul)和生理盐水覆盖切口(5X5X5mm3)。抗体组于术后1d、4d、8d、12d分别向腹腔内注射抗体,SCT组、BDNF过表达组腹腔内注射生理盐水,注射量为第1d10ul/g(抗体浓度为1ug/u1),4d,8d,12d减半。3.神经行为学测定：①对各组小鼠后肢进行运动功能评定,每两天做BBB评分一次。②感觉功能测定,术后1月对所有各组小鼠进行甩尾反射检测。4.神经再生检测：于术后第1月灌注取材,每组3只小鼠,进行NeuN、 GAP-43、5-HT、GFAP免疫组织化学染色,检测神经再生情况。5.信号分子变化检测：术后3天活体取材,每组3只小鼠,每只小鼠取脊髓损伤上下第1-2节段进行Western-Blot,检测信号通路中AKT、ERK蛋白以其相应的磷酸化蛋白(PAKT, PERK)含量变化。6.统计学分析：用SPSS17.0进行统计学分析结果1.成功构建了BDNF过表达转基因小鼠,并确定26号为BDNF过表达率最高转基因小鼠。起蛋白表达在脊髓、肌肉、皮质等组织较野生型明显增加。2.术后各组动物的BBB评分均随着时间的推移逐渐增高。第14天后增加明显(P<0.05),组间比较,21-28天具有统计学差异。ProBDNF抗体封闭组和BDNF过表达组均较单纯SCT组明显增加,有统计学差异。且BDNF过表达组评分优于ProBDNF抗体封闭组(P<0.05)。联合组小鼠神经行为学评分均高于ProBDNF抗体封闭组和BDNF过表达组。3.与假手术组比较,,各损伤组动物的甩尾反射时间均明显缩短(P<0.05)。与SCT组比较,BDNF过表达组亦明显缩短(P<0.05)。ProBDNF抗体封闭组与其它损伤组比无明显变化。而联合组甩尾反射时间与BDNF过表达组比较明显延长(P<0.05)。4.免疫组化染色显示,假手术组脊髓形态结构正常,神经元胞体丰满,突起清晰。脊髓损伤组损伤头侧前角NeuN阳性细胞数,GAP-43和5-HT染色纤维数明显较假手术组减少(p<0.05)。而ProBDNF抗体封闭,BDNF过表达和联合组的NeuN阳性细胞数,GAP-43和5-HT染色纤维数均较SCI组明显增多(p<0.05),且联合组增加最为明显,然后依次为BDNF过表达组,ProBDNF抗体封闭组。SCT组小鼠脊髓前角GFAP阳性细胞的表达较假手术组明显增加(P<0.01),与SCT组相比,实验组GFAP阳性细胞均明显减少(P<0.05)。但联合组与ProBDNF抗体封闭组相比明显减少(P<0.05)。而与BDNF过表达组相比联合组明无显著差异。5. Western-Blot结果ERK和P-ERK联合组损伤脊髓的ERK水平比假手术组明显增加(P<0.01),其余各组的ERK相比均无统计学差异：比较之,联合组的P-ERK不仅比假手术组显著增加(P<0.05),而且比SCT组显著增加(P<0.05),其余各组的P-ERK差异不明显。AKT和P-AKT与假手术组、SCT组和过表达组比较,联合组的AKT明显增加(P<0.05),其余各组相比无统计学差异；而P-AKT仅仅在联合组表达较假手术组明显增加(P<0.05),其余各组相比无明显差异。结论1.成功构建了BDNF过表达转基因小鼠,并利用其制作了脊髓全横断损伤模型2.ProBDNF抗体封闭联合BDNF过表达明显促进了全横断小鼠运动功能感觉和运动功能的恢复；3. ProBDNF抗体封闭联合BDNF过表达有效促进损伤小鼠脊髓横断神经元存活和神经纤维再生；4. ProBDNF抗体封闭联合BDNF过表达改进神经行为学和形态学可能与上调信号分子AKT, P-AKT和erk, p-erk水平有关。