类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种以滑膜炎症、关节骨与软骨破坏为主要特征的慢性、全身性自身免疫病。RA骨破坏一般开始于病程的早期,50%的类风湿关节炎患者在发病2年内即可出现骨破坏,而骨破坏一旦发生,则不可逆的进展。RA归属于中医学的“尪痹”病,湿热瘀是活动期RA核心病机,也是导致RA骨破坏的病理关键,因此其治疗当以清热利湿、活血通络为则。清热活血方是我科治疗湿热瘀阻证RA的常用方药,前期研究结果显示清热活血方调节Th/RANKL通路、DKK/Wnt通路影响破骨细胞、成骨细胞的生成、分化等过程降低RA疾病活动度,延缓RA骨破坏,发挥骨保护的作用。成骨细胞和破骨细胞的平衡是维持正常骨量的关键,对于骨形成和骨吸收这样两个相反的过程,清热活血方是通过调节机体的哪些因素而协同调节骨形成和骨吸收过程平衡的?近年来不断深入的外泌体研究为解决该问题提供了可能。外泌体是细胞的胞内体与细胞膜融合释放到细胞外的小囊泡,内含有miRNA等生物信息,可将其运输至靶细胞,调控信号转导通路和基因表达。miRNA是一类结构高度保守的非编码的RNA分子,通过转录后抑制蛋白编码基因的表达从而调控多条生物学通路。研究发现外泌体miRNA在RA的发生发展中具有重要作用,不仅参与RA炎症相关过程,而且通过对成骨细胞、破骨细胞及软骨细胞作用影响骨代谢。因此,提出本研究的科学假说:清热活血方可能通过调控外泌体miRNA途径治疗RA,延缓骨破坏,发挥骨保护的作用。其具体的调控途径又是如何?清热活血方作为一个中药复方,其作用是多途径、多靶点的,为进一步研究药物的靶向作用,按照“君臣佐使”的组方原则对复方药物进行优化,提取复方中的核心药物组成的简化复方与清热活血方进行比较是否具有同样的疗效呢?本研究通过以下三个研究进行探索:通过对符合标准的RA患者血清外泌体进行高通量测序分析,筛选出参与RA骨破坏差异表达的miRNA;采用清热活血方干预CIA大鼠模型,结合研究一的结果,探索清热活血方对外泌体miRNA的干预作用,并找出其可能的调控途径;比较清热活血方与简化复方的疗效差异及相关作用机制,探索方药的进一步的优化,为后续的研究奠定基础。研究一:类风湿关节炎患者血清外泌体miRNA表达谱研究目的:比较湿热瘀阻证RA患者与健康受试者外周血血清外泌体差异表达的miRNA,探寻miRNA参与RA骨破坏的可能作用途径及机制。方法:选取符合标准且性别、年龄相匹配的湿热瘀阻证RA患者与健康受试者各8人,空腹状态下抽取受试者外周血8ml,分离出血清后采用试剂盒法提取外泌体,并采用粒径测定、透射电镜拍照、Western Blot等方法鉴定外泌体。运用高通量测序技术,筛选外泌体差异表达的miRNA。采用RNAhybrid,miRanda,TargetScan数据库对差异miRNA进行预测靶基因,并选取三个数据库预测的交集作为候选靶基因。通过GO富集及KEGG Pathway富集分析,探寻其参与的生物过程及作用的信号通路。结果:两组受试者一般特征具有可比性。分析提取的外泌体的粒径、形态学测定及表面特异性蛋白与文献报道一致。正常组miRNA数量为474个,RA组miRNA数量370个;两组共有150个差异表达的miRNA,与正常组比较,上调33个,下调117个。其中显著差异表达miRNA有5个,hsa-miR-214-3p上调,hsa-miR-193b-3p、hsa-miR-376a-3p、hsa-miR-30a-5p、hsa-miR-140-3p 下调;一般差异表达 miRNA 有 4 个,hsa-miR-3074-5p、hsa-miR-27a-5p、hsa-miR-496、hsa-miR-429下调。对两组显著差异表达的9个miRNA进行靶基因预测分析,共筛选出2338个靶基因。共有统计学意义的GO功能425个,其中细胞组成部分116个,分子功能部分102个,主要包括蛋白质结合、转移酶活性等;生物过程部分207个,主要包括蛋白质磷酸化、自噬、细胞内信号转导等。显著差异意义的通路 3 个,即差异表达 miRNA 靶基因在 Autophagy、Mitophagy、MAPK signal pathway富集最显著。结论:hsa-miR-214-3p,hsa-miR-193b-3p、hsa-miR-376a-3p、hsa-miR-30a-5p、hsa-miR-140-3p等参与湿热瘀阻证RA骨破坏的病理过程,并具有成为RA骨破坏潜在应用价值的生物标志物;MAPK信号通路是RA骨破坏过程中重要的转导通路,蛋白质磷酸化、细胞自噬、细胞内信号转导、线粒体等功能异常可能是RA骨破坏的发生机制。研究二:清热活血方对类风湿关节炎外泌体miRNA干预作用研究目的:探讨清热活血方对大鼠血清外泌体miRNA的干预作用,并找出其作用的外泌体miRNA调控途径。方法:12只雌性SD大鼠,随机分为正常组、模型组和清热活血方组,每组4只,首次免疫10天后开始药物干预,治疗周期为4周。提取大鼠血清外泌体,采用DEGseq软件基于MA-plot计算差异miRNA的表达,Fold Change绝对值≥1,Qvalue<0.01 认为有差异表达。采用 RNAhybrid,miRanda,TargetScan 数据库进行预测靶基因,并取三个数据库预测的交集作为候选靶基因。通过GO功能显著性富集分析确定差异表达miRNA对应的靶基因行使的主要生物学功能。Qvalue≤0.05的Pathway定义为在差异表达基因中显著富集的Pathway。通过Pathway显著性富集能确定差异表达miRNA的靶基因参与的最主要生化代谢途径和信号转导途径。结果:与Normal组比较,Model组大鼠血清外泌体差异表达的miRNA共有355个,其中上调的miRNA有145个,下调的miRNA有210个。与Model组相比,QRHX组大鼠血清外泌体差异表达的miRNA共有486个,其中上调miRNA有358个,下调的miRNA有128个。Model/Normal与QRHX/Model具有反向作用,在数据库中存在miRNA有49个,有37个miRNA在QRHX组干预下,使Model组比Normal组上调的miRNA下调,有12个mi RNA在QRHX组干预下,使Model组比Normal组下调的miRNA上调。结合研究一结果,对筛选出的miR-214-3p和miR-30a-5p 进行靶基因预测,miR-214-3p 靶基因有 ATF4、RUNX3、STAT6、CADM1 等,miR-30a-5p靶基因有ADAM19、FOXD1、BCL-2、SEPT7等。靶基因主要参与了蛋白质的修饰、离子结合、细胞分化、核酸结合转录因子激活、细胞骨架依赖性细胞内转运等生物过程。靶基因显著富集在MAPK signaling pathway、Endocytosis、Ras signaling pathway、Rapl signaling pathway、Tight junction、Calcium signaling pathway、Oxytocin signaling pathway 等信号通路。结论:多种外泌体miRNA的异常表达参与了 CIA大鼠模型骨破坏的病理过程。miR-214-3p和miR-30a-5p可能是RA发病中的起始部分或中心节点,清热活血方可能通过miR-214-3p-ATF4等及miR-30a-5p-ADAM19等调控轴多途径、多靶点干预RA骨破坏的病理过程。研究三:清热活血方治疗类风湿关节炎的方药优化研究目的:探讨清热活血方与简化复方治疗RA骨破坏的疗效是否存在差异及相关作用机制,探索复方的进一步优化。方法:60只SD雌性大鼠随机分为正常组、模型组、清热活血方组、清热活血简化复方组、益赛普组,每组10只,首次免疫10天后开始药物干预,治疗周期为4周。取4只大鼠进行血清外泌体测序分析,结合研究二测序结果,筛选简化复方干预RA作用的外泌体miRNA,并与清热活血方调控的miRNA进行比较。观察大鼠关节病理切片、双后肢肿胀体积及肿胀积分变化、体重变化、测定关节组织破骨细胞数目及后肢骨密度。采用ELISA法检测血清中TNF-α、IL-1 β、IL-17、骨吸收指标MMP-9、TRAP和骨形成指标ALP、OC表达水平。结果:在首次免疫后第10天各组CIA大鼠双后肢足肿胀开始出现,并逐步加重严重者双前肢亦可见明显肿胀,至21d达到阶段高峰,24d有下降趋势,28d又再度升高,而后逐渐下降。与模型组比较,清热活血简化复方上调9个miRNA,下调25个miRNA。清热活血方和简化复方具有相同调节作用的miRNA有22个,其中4个表达上调,18个表达下调。病理切片显示模型组大鼠关节间隙明显变窄,可见大量炎症细胞浸润,滑膜组织明显增生,关节软骨及关节面出现不同程度的破坏。清热活血方组大鼠较模型组滑膜组织增生、炎症细胞浸润、关节软骨破坏减轻,关节结构相对完整。简化复方组大鼠滑膜组织增生,部分与关节软骨融合,出现了骨侵蚀,关节间隙变窄。与模型组对比,清热活血方组(P<0.001)及益赛普组破骨细胞数目(P<0.05)均有统计学差异,简化复方组差异无统计学意义(P>0.05);与清热活血方组比较,简化复方组差异具有统计学意义(P<0.05)。各造模组CIA大鼠骨密度明显低于正常组(P<0.05);与模型组对比,清热活血方组、简化复方组及益赛普组大鼠骨密度值有明显增加(P<0.05),三组大鼠的骨密度比较无统计学差异(P>0.05)。清热活血方降低TRAP、MMP-9、IL-1 β、IL-17、TNF-α水平方面优于简化复方组(P<0.05),升高OC、ALP水平方面与简化复方组无统计学差异(P>0.05)。结论:清热活血方与简化复方均可通过影响外泌体miRNA干预RA骨破坏病理过程。清热活血方和简化复方均可以减轻CIA大鼠关节肿胀度,抑制关节炎症细胞浸润和滑膜增生;抑制TNF-α、IL-17、IL-1β等促炎细胞因子的表达,减轻炎症程度;抑制破骨细胞的生成,延缓骨破坏和关节破坏部位骨质代偿性的过度增生,发挥“骨保护”的作用。清热活血方整体疗效优于简化复方。