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肉桂醇酯是一类非常重要的芳香类化合物,具有令人愉快的果香、花香气息,广泛的被应用于食品、日化以及医药行业。其合成方法受到国内外研究者的广泛关注。目前,市面上的肉桂醇酯大部分是由化学方法合成。在香精香料的生产过程中,化学反应虽然催化效率较高,但存在催化剂制备工艺复杂,反应条件苛刻,生成大量副产物导致目的产物分离困难,有害物质排放量大等问题。这些因素很大程度上影响了产物的纯度以及品质。与传统的化学合成法相比,酶促反应合成香精香料以其催化效率高,反应条件温和,产物纯度高以及环境友好等特点,开始受到人们的青睐。因此,为酶促合成肉桂醇酯找到合适的生物催化剂,实现其绿色酶法制备,并使该方法能在工业上大规模使用,具有广泛的经济效益,成为目前研究的热点。商品脂肪酶酶活较高,能高效催化各种酯化、转酯、水解反应,且便于回收和重复使用,但其价格昂贵,无法大规模的应用于工业上生产。而毕赤酵母能够高效地表达外源蛋白,利用这一特性,通过酵母细胞表面展示系统将脂肪酶CALB锚定在毕赤酵母细胞表面,然后将其进行高密度发酵,得到大量表面展示有CALB脂肪酶的毕赤酵母细胞。再经过低温冷冻干燥即可作为全细胞生物催化剂应用到有机合成反应中。该全细胞生物催化剂不但具有固定化酶的优点,且生产工艺简单,能够有效降低工业生产成本。首先,针对市面上作为香精香料的肉桂醇系列酯,利用本实验室自制毕赤酵母表面展示脂肪酶CALB(Candida antarctica lipase B-displaying Pichia pastoris,Pp-CALB),对其合成的可行性进行了一个初步探索,随后对Pp-CALB合成附加值较高的乙酸肉桂酯的反应条件进行了系统优化。乙酸肉桂酯的合成:在无溶剂体系中,通过全细胞生物催化剂Pp-CALB催化肉桂醇与乙酸乙烯酯发生转酯反应合成乙酸肉桂酯。并对影响反应的因素进行了系统优化,优化后的反应条件为:在10 ml具塞锥形瓶中,加入6 mmol肉桂醇,体系初始水活度0.53,底物摩尔比(乙酸乙烯酯:肉桂醇)2:1,摇床转速120 r/min,反应温度50℃,Pp-CALB 0.05 g,反应3 h,肉桂醇酯化率可达81.34%。过滤回收反应后的Pp-CALB,将其洗净喷干,用于下一次反应,连续反应8次,肉桂醇酯化率仍可达到70.00%以上,全细胞生物催化剂Pp-CALB表现出了良好的操作稳定性。在单因素优化基础上,以反应温度,底物摩尔比,Pp-CALB添加量,摇床转速等显著影响因素作为实验因素,采用四因素三水平的正交实验设计,研究这4个因素及其交互作用对肉桂醇酯化率的影响。经过系统分析,得出最佳反应条件:反应温度50℃,摇床转速120 r/min,Pp-CALB添加量0.06 g,底物摩尔比(乙酸乙烯酯:肉桂醇)1.5,体系初始水活度0.53,反应时间3 h。肉桂醇酯化率接近89.00%,高于单因素条件优化下的肉桂醇酯化率(81.00%)。在摇瓶反应体系的正交实验优化基础上,采用2 L搅拌反应装置,将反应体系放大到2 L。在体系初始水活度0.53,Pp-CALB添加量31.3 g,底物摩尔比1.5,搅拌转速120 r/min,反应温度50℃的条件下,反应3.5 h,肉桂醇酯化率达到88.00%以上,与摇瓶反应水平基本齐平。结果表明,全细胞生物催化剂Pp-CALB在反应放大过程中仍可高效催化合成乙酸肉桂酯,且放大反应重现性较好。最后,利用减压蒸馏法对反应液中的乙酸肉桂酯进行了粗提取,得到的乙酸肉桂酯产品纯度可达87.24%。本研究为毕赤酵母表面展示脂肪酶CALB工业化生产肉桂醇系列酯提供了可靠依据。