论文部分内容阅读
聚乳酸-羟基乙酸共聚物（poly（lactic-co-glycolic acid）,PLGA）是一类广泛用于制备纳米载体的可降解的高分子聚合物材料,具有无毒、无刺激性,可降解及生物相容性好等优点,在生物环境中可保护溶解性低和稳定性差的药物。但PLGA纳米粒在人体内易被巨噬细胞识别后吞噬,将白蛋白包裹在PLGA纳米粒最外层可有效改善这种情况,从而延长体内循环时间,改善药代动力学。白蛋白修饰后还可增加肿瘤靶向性。卡巴他赛（Cabataxel,CTX）作为第二代紫杉烷类抗肿瘤药物,其水溶性差,对肿瘤组织缺乏靶向性,并具有一定的毒副作用,因此本课题采用人血清白蛋白（Human Serum Albumin,HSA）仿生PLGA为纳米载体负载化疗药物CTX,改善其缺点,增强抗肿瘤活性。大量研究表明使用多种治疗方法联合治疗肿瘤,与使用单独某种治疗手段治疗相比治疗效果会得到显著的增强。光热疗法温和且副作用小,与化疗联用可有效增强抗肿瘤效果,因此本课题选择FDA批准的近红外染料吲哚菁绿（Indocyanine Green,ICG）,和CTX共同负载于人血清白蛋白仿生PLGA纳米粒,以期达到光热-化疗联合治疗的目的,增强肿瘤治疗效果。本课题首先制备了负载卡巴他赛的白蛋白仿生PLGA纳米粒（CTX-PLGA/HSA NPs,CPHNs）。建立了以高效液相色谱法为主的卡巴他赛含量测定方法,并进行了方法学验证,专属性、精密度、回收率等均符合卡巴他赛的含量测定要求。同时确定了CPHNs包封率和载药量的测定方法。采用超声-乳化法制备CPHNs,以粒径、多分散系数、包封率和载药量为评价指标,对CTX投药量、PLGA用量、HSA溶液浓度、油相溶剂的种类、油水相体积比、超声功率、超声时间及搅拌时间进行单因素考察,并选择对纳米粒粒径和包封率影响最大的三个因素结合Box-Behnken Design响应面优化法对处方进行优化,确定CPHNs的最优处方。测定CPHNs的平均粒径为109.90±0.79 nm（PDI为0.145±0.010）,Zeta电位为-11.14±2.49 mV,透射电镜观察CPHNs呈类球形,大小均一,有明显的HSA修饰层。测得CPHNs的包封率为60.97±1.58%,载药量为2.40±0.36%。随后制备了同时负载ICG和CTX的白蛋白仿生PLGA纳米粒（ICG-CTX-PLGA/HSA NPs,ICPHNs）,水相中加入ICG和3%PVA溶液作为乳化剂,其余制备方法与CPHNs相同。通过紫外光谱分析发现ICG与ICPHNs有相同的吸收峰,证明成功制备ICPHNs。激光粒度仪测得ICPHNs与CPHNs相比,粒径稍有变大,约为119.72±0.79 nm（PDI为0.174±0.025）,Zeta电位为-7.12±2.89,透射电镜观察到为大小均一的球形纳米粒,有明显的HSA修饰层。加入ICG后纳米粒对CTX的包封率没有明显的变化,约为61.23%,对ICG的包封率约为72.56%。初步稳定性考察发现5天内ICPHNs在超纯水,生理盐水及PBS中的粒径没有发生较大变化,在胎牛血清中72h内也保持较好的稳定性。ICPHNs与游离ICG相比也大大提高了其荧光稳定性。循环光热升温实验证明ICPHNs提高了ICG的光热稳定性。体外光热升温实验表明ICG浓度为15μg/mL的纳米粒子在1.5W/cm~2的808nm近红外激光照射下能够升温至50℃以上。体外释放实验表明ICPHNs有一定的缓释效果,且有HSA修饰层的纳米粒与没有修饰层的纳米粒释放效果存在差异。光触发下的药物释放实验证明光照能够让纳米粒子升温破裂,从而使化疗药物在特定部位更快释放,达到治疗效果。体外活性氧（Reactive Oxygen Species,ROS）检测发现ICPHNs相较游离ICG产生ROS更多,有更好的抗肿瘤效果。溶血实验发现ICPHNs样品的溶血百分率均小于5%,表明该制剂安全无毒,适宜静脉注射给药。为证明ICPHNs的体外抗肿瘤活性,以4T1细胞为模型,进行体外抗肿瘤活性实验。将细胞与ICPHNs共同孵育后激光照射,采用DCFH-DA荧光探针检测细胞内的活性氧产生情况,结果表明ICPHNs与细胞孵育后通过激光照射能够产生大量活性氧,从而达到杀死肿瘤细胞的效果。对空白载体PLGA/HSA NPs进行细胞毒性实验,结果表明空白载体无明显的细胞毒性。对游离ICG、IPHNs+Laser、ICPHNs和ICPHNs+Laser进行细胞毒性实验,结果表明光热-化疗联合治疗的细胞存活率显著低于单独光热治疗和化疗组,证明了ICPHNs能够达到联合治疗的目的,增强治疗效果。细胞摄取实验表明HSA对纳米粒的修饰以及激光照射都能使细胞对纳米粒的摄取增多,从而提高抗肿瘤作用。通过免疫荧光染色发现ICPHNs治疗后胞内钙网蛋白（Calreticulin,CRT）荧光增强,高迁移率族蛋白（High-mobility Group Box 1,HMGB1）荧光减弱,证明ICPHNs相较游离ICG能够引起更强的ICD,增强对肿瘤细胞的杀伤作用。最后建立小鼠皮下4T1肿瘤模型进行体内抗肿瘤活性研究,实验发现,ICPHNs加激光联合治疗组小鼠体重无明显变化,肿瘤体积和重量明显减小,证明ICPHNs无明显毒性,同时可达到联合治疗肿瘤的目的,体内抗肿瘤活性较好。