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肝癌是全世界范围内最常见的恶性肿瘤之一,其发病率和死亡率呈逐年上升趋势,严重威胁着人类的健康。虽然肝移植、肿瘤切除及非切除性的局部疗法如肝动脉化疗栓塞等是针对肝癌的主要医治手段。由于肝癌特别是原发性肝癌（HCC）早期易发生转移且治疗后易复发,因此,寻找一个可以准确判断预后的指标和有效的肝癌治疗靶点具有重要意义。早期诊断和治疗是提高原发性肝细胞癌疗效的关键因素之一。磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（Glypican 3,GPC3）作为硫酸乙酰肝素蛋白聚糖家族成员,它参与调控细胞增殖、调控、粘附和迁移等过程。有研究显示GPC3原发性肝癌中特异性高表达,而在成人正常肝组织低表达或不表达。从而提示GPC3对肝癌诊断具有显著的灵敏性和特异性,可作为识别原发性肝癌（HCC）特异性肿瘤标志物。通过PCR扩增人GPC3基因并将其构建至pET28a原核表达载体,在大肠杆菌BL21表达菌株中诱导表达磷酯酰肌醇蛋白聚糖融合蛋白,利用亲和层析的方法纯化his-融合蛋白,通过SDS-PAGE电泳检测蛋白的纯度,并测定蛋白含量。此外,还借助生物信息学在线软件对GPC3基因结构与功能进行生物学信息预测。将已纯化的GPC3蛋白免疫新疆双峰驼,构建VHH噬菌体展示文库,经三轮亲和淘选,筛选获得抗GPC3的纳米抗体。通过体外ELISA验证,抗原结合特异性。流式细胞实验初探对其肝癌细胞靶向识别效应。结果表明,成功构建pET28a-GPC3原核表达载体,优化诱导表达条件,在温度为32℃,浓度为0.5mmol/L的IPTG,诱导时间为6h的条件下融合蛋白表达量较高,通过亲和层析纯化,获得分子量大小约为70kDa的GPC3融合蛋白,生物信息学分析GPC3蛋白为稳定的亲水性蛋白,具有信号肽,主要定位于细胞质膜。二级结构元件主要以α螺旋,β折叠为主。有18个Ser、7个Thr、23个Tyr等能够成为蛋白激酶磷酸化位点。GPC3蛋白与Wnt信号家族蛋白具有相互作用。免疫新疆双峰驼成功构建VHH噬菌体展示文库,获得抗体库的库容为1.608×106cfu/ml,噬菌体展示文库滴度为6.5×1013pfu/ml,经三轮富集抗体特异性逐步提高。成功构建pET28a-VHHGPC3原核表达载体,并纯化出条带较单一,分子量大小约为13kDa的融合蛋白。获得的纳米抗体不仅能与商品化真核系统表达的GPC3蛋白特异性结合,而且能特异性识别人肝癌HepG2及BEL-7404细胞表面的GPC3蛋白,且实验组与阴性对照组相比,FITC荧光强度具有极显著差异。此外,VHHGPC3与BEL-7404肝癌细胞亲和力较高。