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背景和目的组蛋白(Histone)是将DNA组装和包裹形成核小体的小分子碱性蛋白。核组蛋白的乙酰化作用和去乙酰化作用与基因的转录有关，且在调节基因表达和染色质凝集方面具有重要作用，因此，提出一种可通过抑制去乙酰化酶的作用进而治疗人类肿瘤的新的治疗方式。近些年，大量研究资料显示，去乙酰化酶抑制剂通过调节大多数基因表达发挥其不同的抗癌作用，并且目前已被应用于多种临床试验研究中检测它的效用。丁酸钠(sodium butyrate，SB)是膳食纤维在肠道中酵解后产生的一种无毒的短链脂肪酸，是人体最基本的生理性去乙酰化酶抑制因子，对预防结直肠癌的发生有重要的保护作用。早期研究证实丁酸钠具有抑制细胞增殖和诱导细胞分化以及促进体外多种肿瘤细胞凋亡的作用。然而，丁酸钠诱导细胞凋亡以及下游受体参与凋亡发生的机制目前还不清楚。大量研究表明细胞接受凋亡信号刺激后，至少经过两条特征性的凋亡途径即Caspase(Cysteinyl aspartate-specific proteinases)依赖和非依赖途径。其中一种是凋亡发生的主要途径，即通过结合Fas受体由此激活Caspase-8启动凋亡的Caspase依赖途径。有活性的Caspase-8同时也激活Bcl-2家族的促凋亡因子，如Bax能触发一系列的凋亡事件发生，导致线粒体膜的通透性增加、线粒体肿胀、线粒体内膜的跨膜电位(△ψm)下降，以致线粒体中细胞色素C和Smac/Diablo释放入胞浆，细胞色素C与Apaf-1结合Caspase-9形成凋亡体(apoptosome)，并在dATP辅助下，激活Caspase-9。Caspase-9再酶解Caspase-3前体，释放出C末端小肽片段，从而活化Caspase-3，并参与到级联反应中，裂解个别的酶作用底物如PARP，引起线粒体DNA断裂和形态学改变等细胞凋亡特征。与此同时，Smac/Diablo结合上Caspase-3抑制物，增加Caspase-3活性。Caspase不是唯一引起细胞凋亡的影响因子，一些其他的线粒体前凋亡蛋白如AIF是以Caspase非依赖方式调节细胞凋亡同时从线粒体内膜间隙被释放出来。AIF以Caspase非依赖的方式位移到细胞核并参与染色质初期的凝集和大多数DNA断裂。近年来，丁酸钠诱导细胞凋亡中与Caspase所起的相关作用报道很多，例如，丁酸钠通过改变蛋白活性加强肝癌细胞对Fas信号途径Caspase的敏感性；丁酸钠诱导的肺癌，前列腺癌和宫颈癌细胞凋亡需要激活的Caspase-3的参与；丁酸钠治疗白血病和成神经管细胞瘤与凋亡中的Caspase-8有关；在结直肠肿瘤细胞中丁酸钠诱导细胞发生凋亡关键是有细胞色素C释放及Caspase-9的参与等。到目前为止，AIF等细胞凋亡诱导因子在凋亡过程中所起的作用，特别是在丁酸钠诱导的食管癌细胞株Eca-109细胞凋亡是否有AIF参与还没有相关报道。本试验利用MTT比色法和DNA琼脂糖电泳检测Eca-109细胞凋亡的发生；利用Western blotting技术，通过研究细胞色素C从线粒体转移到胞浆，AIF从线粒体内膜的释放等凋亡发生事件以及与Caspase的关系，来进一步阐明丁酸钠诱导食管癌细胞株Eca-109细胞凋亡发生的机制。方法1．MTT法测定丁酸钠对Eca-109细胞的生长抑制率。试验分三组：①试验组：分别加入1mmol/L、2.5mmol/L、5mmol/L三种不同浓度的丁酸钠；②阴性对照组：不加药物；③空白对照组：加入等体积的生理盐水。每个浓度设四个平行孔，分别作用Eca-109细胞24h、48h、72h后测定细胞在570nm波长吸光度值，计算细胞生长抑制率，以上试验重复3次，求平均值。2．用DNA琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡；用western blotting技术检测2.5mmol/L丁酸钠处理Eca-109细胞后，Caspase-8的活性在不同作用时间的表达情况以及检测在丁酸钠处理前后线粒体和胞浆中细胞色素C及凋亡相关蛋白AIF蛋白表达的变化，并用图文分析系统进行分析。结果1．丁酸钠对Eca-109细胞的增殖抑制作用丁酸钠对Eca-109细胞生长有明显的的抑制作用。丁酸钠浓度为1mmol/L、2.5mmol/L、5mmol/L处理Eca-109细胞，分别测定各浓度组在24h、48h、72h后细胞生长抑制率。处理24h后各浓度组细胞生长抑制率分别为13.38％、33.40％、39.04％；处理48h后各浓度组细胞生长抑制率分别为14.06％、34.25％、46.50％；处理72h后各浓度组细胞生长抑制率分别为32.10％、40.65％、48.23％。细胞生长抑制率随药物浓度增加、作用时间延长而升高，具有明显的时间—剂量依赖性。与1mmol/L组比较：2.5mmol/L和5mmol/L浓度组在24h、48h、72h的各个时间段比较均有统计学意义(P＜0.01)；与2.5mmol/L组比较：5mmol/L浓度组在24h、72h时间段有统计学意义(P＜0.05)，5mmol/L浓度组在48h有统计学意义(P＜0.01)。与24h比较：在48h时5mmol/L浓度组有统计学意义(P＜0.01)，72h时各浓度组均有统计学意义(P＜0.05)；与48h比较：2.5mmol/L浓度组在72h有统计学意义(P＜0.05)，1mmol/L浓度组在72h有统计学显著性差异(P＜0.01)。2．丁酸钠诱导Eca-109细胞凋亡的作用2．1丁酸钠2.5mmol/L作用于Eca-109细胞48h、72h后，DNA琼脂糖凝胶电泳结果显示，加药组有明显的DNA梯形凋亡条带，未加药组无明显的DNA梯形凋亡条带出现。2．2 Western blotting技术检测2.5mmol/L丁酸钠处理Eca-109细胞在0h、12h、24h、48h、72h后的Caspase-8的活性，发现从12h开始出现caspases-8的活性单位，到48h达到高峰，72h与48h的caspases-8活性单位没有明显差别。结果显示caspases-8活性单位随着丁酸钠处理时间延长表达增强，具有一定时间依赖性。结果表明丁酸钠诱导Eca-109细胞凋亡可能依赖caspases凋亡途径进行。2．3 Western blotting技术检测Eca-109细胞中有细胞色素C及AIF蛋白分布。2.5mmol/L丁酸钠细胞处理48h后二者在线粒体中表达明显降低，而在胞浆中表达增强。结论1．丁酸钠对Eca-109细胞有显著的抗增殖作用，其抗增殖作用呈明显的剂量—时间依赖关系。2．丁酸钠抗Eca-109细胞增殖是通过诱导细胞凋亡而进行，可能是以Caspase依赖及非依赖两种方式进行。3．丁酸钠诱导Eca-109细胞凋亡与细胞色素C和AIF从线粒体释放入胞浆有关。