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研究背景Microwell-seq,为课题组自主研发的单细胞测序技术。该方法通量高、成本低。急性髓系白血病,是起源于造血干细胞的恶性克隆性疾病,具有高度异质性。单细胞测序技术,能揭示单个细胞的基因表达状态,反映细胞间的异质性。将单细胞转录组测序与AML结合,能深入了解肿瘤及微环境中,细胞与细胞之间的变化,对致病机制进行深度解析。由于基因表达的复杂性,不同患者,治疗方案及预后差异较大。尤其是复发及难治的患者,生存期往往较短。目前,精准治疗可通过精确靶标,提升患者预后。利用单细胞测序技术,将患者的细胞异质性与预后相关联,进行预后评估,探索疾病治疗靶点,具有巨大临床价值。第一章微孔板单细胞测序的平台优化目的:进一步优化Microwell-seq实验流程、提高测序质量。方法:通过改进微孔板单细胞测序材料设备,改良实验流程,优化Microwell-seq实验。结果:1)设计PDMS微孔板一体化组件,使落板、裂解能够自动化;2)逆转录后添加循环步骤,提升c DNA文库浓度。结论:在流程自动化、步骤优化后,得到更好的测序结果。第二章AML单细胞图谱绘制及异质性分析目的:在单细胞水平,研究正常造血细胞谱系分化,进而研究AML单细胞分群、基因表达特征、细胞突变追踪。方法:正常造血细胞单细胞分析部分,先用Microwell-seq,对3例正常对照者正常BMMC进行单细胞测序;利用t-SNE,进行单细胞分群并鉴定;加入造血干祖细胞（Haematopoietic Stem and Progenitor Cell,HSPC）及外周血单个核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cell,PBMC）,利用PAGA进行分化轨迹分析。AML单细胞分析部分,先用Microwell-seq,对40例初发AML患者的191727个BMMC进行单细胞测序;利用t-SNE,进行单细胞分群并鉴定;利用相关性分析,分析AML祖细胞群与各群关系;利用sc-blast,分析AML祖细胞群与其他正常组织内免疫细胞相似性;将AML祖细胞群与HSPC进行比较,进行基因表达谱和特异性转录因子（Transcription Factor,TF）分析;对AML祖细胞群进一步进行t-SNE细分,分析各群功能倾向;利用三代长片段单分子实时（Single Molecule RealTime,SMRT）测序,结合线粒体突变,进行肿瘤细胞突变追踪分析。结果:1)构建正常造血细胞单细胞图谱,通过不同血细胞标志基因鉴定各群,并在HSPC和PBMC分化轨迹中进行验证;2)构建AML单细胞图谱,鉴定AML特异性祖细胞群,其与正常髓系细胞、HSPC均有一定关联,但在其他正常组织的免疫细胞中相似性低;3)AML祖细胞群高表达RP基因,并有其特异性原始基因及TF;4)AML祖细胞可进一步细分4个群组,分别为RP基因高表达群组、类中性粒细胞群组、类单核细胞群组、类髓系细胞群组;5)线粒体突变在各谱系均匀分布,肿瘤细胞在不同转录调节网络（Transcriptional Regulatory Network,TRN）作用下,进入各谱系,解析肿瘤吸引子模型。结论:构建了正常造血细胞和AML的单细胞图谱,AML有特异性致病祖细胞群,高表达RP基因,且该群可进一步分为4个亚群,肿瘤细胞符合吸引子模型。第三章AML单细胞预后追踪分析目的:在单细胞水平,研究AML不同分群与预后的关系,并挖掘潜在治疗靶点。方法:根据不同患者,在AML祖细胞亚群中,细胞分布情况,分析其与预后关系;利用个体t-SNE分群图特点,在单细胞水平,对患者进行重新分类,并分析预后特点;追踪患者治疗后情况,利用UMAP（Uniform Approximation and Projection）分群、细胞相对比例分析、相关性分析、差异表达基因（Differential Expressed Gene,DEG）分析,探索治疗前后基因表达改变情况;根据治疗反应情况,将难治患者与非难治患者进行分群比较,分析两者特异群中基因表达差异及与预后关系;根据人类细胞图谱（Human Cell Landscape,HCL）,通过差异基因分析,分析AML中高表达而HCL中低表达的基因。结果:1)采用IA方案的患者,其细胞在AML祖细胞亚群中,若主要分布于RP基因高表达群组,则第一疗程缓解率较低;2)根据单个患者单细胞t-SNE分群图,将患者分为高、低异质性类型,低异质性类型患者（类型Ⅰ）年龄偏大,预后较差;3)缓解患者,治疗后分群接近正常对照,AML祖细胞比例降低,RP基因、原始基因表达降低,髓系细胞标志基因表达增高,复发患者则相反;4)针对急性单核细胞白血病患者,难治患者有特异性群,高表达MYC、SRC、RELA、MTOR等肿瘤相关基因;5)通过与HCL比较,AML图谱中,前10位特异性高表达基因为FLT3、POU4F1、PRSS21、CCL1、DNTT以及5个lnc RNA,另有MYB、CCNA1、RAB37,亦特异性高表达。结论:预后情况与基因表达、细胞异质性相关,RP和肿瘤相关基因高表达、细胞异质性低,为治疗反应不良因素;MYB、CCNA1、RAB37,有望成为潜在治疗靶点。