【摘 要】
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次级代谢物是通过复杂的次生代谢途径合成的各种结构复杂的化合物,包括维生素、激素、抗生素、生物碱以及毒素等,这些化合物与人们的生活息息相关。因此,对次级代谢物进行开发和改造,研究相关的合成途径以及合成过程中重要的酶催化机制,是非常有意义的。酶的功能和结构是密切相关的,酶的结构研究是揭示其功能的基础。本论文通过解析两种次级代谢物合成途径中关键酶的晶体结构,从原子水平上揭示了其具体的催化机制,为杀黑星菌
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次级代谢物是通过复杂的次生代谢途径合成的各种结构复杂的化合物,包括维生素、激素、抗生素、生物碱以及毒素等,这些化合物与人们的生活息息相关。因此,对次级代谢物进行开发和改造,研究相关的合成途径以及合成过程中重要的酶催化机制,是非常有意义的。酶的功能和结构是密切相关的,酶的结构研究是揭示其功能的基础。本论文通过解析两种次级代谢物合成途径中关键酶的晶体结构,从原子水平上揭示了其具体的催化机制,为杀黑星菌素A和β-咔啉生物碱的发掘和改造提供了理论依据。(I)大环内酯类抗生素杀黑星菌素A(Venturicidin A,VTD-A),能够抑制大肠杆菌中线粒体的H+-ATP酶,还能够通过抑制多种真菌和细菌中ATP的合成来发挥抗菌活性。杀黑星菌素A具有抗锥虫活性,有望被开发为一种新的抗锥虫药物。杀黑星菌素A还可以作为抗生素佐剂,增强氨基糖苷类抗生素的耐药性,为靶向解决氨基糖苷耐药性提供了一种新的思路。杀黑星菌素A的合成途径包括骨架的形成和后修饰过程,在后修饰过程中,O-氨甲酰基转移酶Vtd B发挥了重要的作用。目前,Vtd B的作用机制和底物识别的分子机制还不清楚。为了确定Vtd B的催化过程,我们体外克隆并表达了Vtd B的蛋白质样品,通过X-射线衍射法解析了Vtd B与氨甲酰腺苷复合物的晶体结构。Vtd B晶体的一个非对称单元有四个分子,每个分子均结合有一个镁离子和一个中间产物氨甲酰腺苷。单体结构包含两个结构域,分别是Kae1-like结构域和Yrd C-like结构域,镁离子和氨甲酰腺苷均结合在Kae1-like结构域。与同源蛋白进行结构比对,确定了Vtd B底物的活性口袋和可能的催化过程。Vtd B与底物氨甲酰磷酸和杀黑星菌素B的活性口袋分别位于两个结构域的交界面和Kae1-like结构域的内部。Kae1-like结构域中,在杀黑星菌素B结合口袋附近,结合了一个镁离子和氨甲酰腺苷,镁离子分别与H157,H161,D180,D363以及氨甲酰腺苷形成配位键。底物活性位点比对发现,氨甲酰磷酸的活性位点是保守的,而杀黑星菌素B的活性位点完全不保守,我们推测Vtd B对杀黑星菌素B的识别方式可能是不同的。(II)β-咔啉生物碱是生物碱家族中重要的一类化合物,具有广泛的生物学活性,长期被用于治疗肿瘤、疟疾等疾病,故对于其生物合成途径的机制研究具有重要意义。在放线菌菌株Kitasatospora setae NBRC 14216T中,β-咔啉生物碱Kitasetaline的β-咔啉骨架由P-S酶Ksl B催化形成,其对肿瘤细胞系中葡萄糖调节蛋白78(GRP78)的表达具有抑制作用,有可能作为抗癌药物的先导化合物发挥作用。Kitasetaline的合成途径中,L-色氨酸和α-酮戊二酸作为起始底物,在Ksl B的作用下,通过形成一个中间化合物kitasetalic acid最终完成合成。因此,作为合成过程中的第一步催化酶,Ksl B催化的具体分子机制对于β-咔啉生物碱kitasetaline的合成研究是极其重要的。在本课题中,我们初步研究了Ksl B和其同源蛋白Asl B的催化活性,并解析了Asl B的三维晶体结构。通过序列比对和结构分析,我们推测Ksl B和Asl B可能具有相同的底物和催化方式。Asl B的整体结构是由两个单体组成的二聚体,每个单体由两个结构域组成,两个底物的结合口袋均位于二聚体中心的区域。在L-色氨酸的结合口袋中,催化活性中心Glu276能够识别色氨酸的氨基,是Asl B催化反应的“酸碱”催化剂,Thr263和Phe98的苯环可以形成吲哚三明治结构来稳定色氨酸的吲哚环。通过结构分析我们发现与L-色氨酸结合的关键氨基酸残基,是比较保守的,而另一种底物α-酮戊二酸结合位点的残基完全不保守,表明Asl B可能通过一种新的作用方式催化α-酮戊二酸与L-色氨酸发生Pictet-Spengler反应。
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