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目的:研究支气管哮喘患者中性粒细胞内是否存在KLF2/RelA比例失衡及与中性粒细胞凋亡的关系方法:收集健康正常人及轻、中、重度哮喘患者外周血,通过FICOLL淋巴细胞分离液分离中性粒细胞,利用流式细胞术检测中性粒细胞凋亡率,利用RT-PCR和Western-blot分别检测KLF2、RelA和Bcl-xlmRNA和蛋白的表达,利用免疫荧光检测KLF2和RelA在细胞内的表达及定位。结果:1中性粒细胞的分离与纯度鉴定成功分离外周血中性粒细胞,经Wright-Giemsa染色鉴定后,中性粒细胞纯度达到95%以上;2哮喘患者中性粒细胞凋亡率变化健康对照组、轻、中、重度哮喘组中性粒细胞凋亡率(5.36±0.57、4.45±0.76、2.10±0.25、1.81±0.67)呈降低趋势,健康对照组、轻、中度哮喘组间两两比较,差异均存在统计学差异(P<0.01),健康对照组、轻度哮喘组与重度哮喘组比较,差异均有统计学意义(P<0.01),中度哮喘组与重度哮喘组之间比较,差异无统计学意义(P>0.05)。3哮喘患者KLF2mRNA和蛋白表达变化及与凋亡的关系1)KLF2mRNA相对表达量:RT-PCR检测KLF2mRNA在各组的表达后发现轻、中、重度哮喘组(0.47±0.11、0.75±0.13、1.17±0.28)呈上升趋势,轻度哮喘组和中度哮喘组比较差异均有统计学意义(P<0.01),中、重度哮喘组间比较差异差异也有统计学意义(P<0.01),中、重度哮喘组与健康志愿者组(1.52±0.37)比较,差异均有统计学意义(P<0.01),重度哮喘组与健康志愿者组(1.52±0.37)比较,差异均有统计学意义(P<0.05)如表3,图3;2)KLF2蛋白相对表达量:Western-blot检测KLF2蛋白在各组的表达后发现轻、中、重度哮喘组KLF2蛋白相对表达量(0.050±0.014、0.066±0.025、0.091±0.023)呈增加趋势,轻度哮喘组和中度哮喘组比较差异均有统计学意义(P<0.05),中、重度哮喘组间比较差异差异也有统计学意义(P<0.01),轻、中度哮喘组与健康志愿者(0.124±0.021)比较均减小,差异均有统计学意义(P<0.01),重度哮喘组与健康志愿者组(1.52±0.37)比较,差异均有统计学意义(P<0.05)如表3,图4;3)KLF2核/浆平均光密度值:免疫荧光检测KLF2在中性粒细胞内的表达及定位,采用Image-Pro Plus6.0检测核/浆平均光密度值发现轻、中、重度哮喘组KLF2核/浆平均光密度值(0.33±0.10、0.58±0.14、0.72±0.15)呈逐渐增加的趋势,轻度哮喘组和中度哮喘组比较差异均有统计学意义(P<0.01),中、重度哮喘组间比较差异差异也有统计学意义(P<0.05),轻、中、重度哮喘与健康志愿者组(0.14±0.04)比较,差异均有统计学意义(P<0.01),如表3,图5;4)中性粒细胞凋亡率与KLF2蛋白表达做Pearson相关性分析(r=0.1208,P>0.05),提示无相关性;5)中性粒细胞凋亡率与中性粒细胞内KLF2核/浆平均吸光度值做Pearson相关性分析(r=-0.7754,P<0.001),提示两者之间呈负相关。4哮喘患者RelAmRNA和蛋白表达变化及与凋亡的关系1)RelAmRNA相对表达:正常对照组、轻、中、重度哮喘组RelAmRNA相对表达量(0.08±0.07、1.11±0.44、2.33±0.56、2.65±0.44)呈上升趋势,正常对照组、轻、中度哮喘组间两两比较,差异均存在统计学差异(P<0.01),健康对照组、轻度哮喘组与重度哮喘组比较,差异均有统计学意义(P<0.01),中度哮喘组与重度哮喘组之间比较,差异无统计学意义(P>0.05);2)RelA蛋白相对表达:对照组、轻、中、重度哮喘组RelA蛋白相对表达量(0.039±0.024、0.092±0.046、0.187±0.045、0.201±0.058)呈上升趋势,正常对照组、轻、中度哮喘组间两两比较,差异均有存在统计学差异(P<0.01),对照组、轻度哮喘组与重度哮喘组比较,差异均有统计学意义(P<0.01),中度哮喘组与重度哮喘组之间比较,差异无统计学意义(P>0.05);3)RelA核/浆平均光密度值:正常对照组、轻、中、重度哮喘组RelA核/浆平均光密度值(0.09±0.04、0.28±0.13、0.63±0.26、0.74±0.24)呈上升趋势,正常对照组、轻、中度哮喘组间两两比较,差异均有存在统计学差异(P<0.01),正常对照组、轻度哮喘组与重度哮喘组比较,差异均有统计学意义(P<0.01),中度哮喘组与重度哮喘组之间比较,差异无统计学意义(P>0.05);4)中性粒细胞凋亡率与RelA蛋白表达做Pearson相关性分析(r=-0.8079,P<0.001),提示两者间呈负关性;5)中性粒细胞凋亡率与中性粒细胞内RelA核/浆平均吸光度值做Pearson相关性分析(r=-0.7332,P<0.001),提示两者之间呈负相关;5哮喘患者KLF2/RelA比例变化及与凋亡的关系1)KLF2/RelA蛋白比值:轻、中、重度哮喘组(9.8±4.4、2.7±1.3、7.8±2.9)较正常对照组(42.1±16.2)降低,差异均有统计学意义P<0.01,轻、中、重度哮喘组间两两比较,差异无统计学意义(P>0.05);2)KLF2/RelA蛋白比值与中性粒细胞凋亡凋亡做Pearson相关性分析(r=0.6689,P<0.001),提示两者之间呈正相关;6哮喘患者Bcl-xl的表达变化正常对照组、轻、中、重度哮喘组Bcl-xl蛋白相对表达量(0.870±0.252、0.481±0.257、0.047±0.031、0.019±0.015)呈降低趋势,正常对照组、轻、中度哮喘组间两两比较,差异均有存在统计学差异(P<0.01),正常对照组、轻度哮喘组与重度哮喘组比较,差异均有统计学意义(P<0.01)中度哮喘组与重度哮喘组之间比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论:1)哮喘患者中性粒细胞凋亡率随着哮喘严重程度的加重而下降;2)哮喘患者外周血中性粒细胞存在KLF2/RelA比例失衡,并且KLF2/RelA比例失衡可能是导致哮喘患者外周血中性粒细胞凋亡减少的机制。