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链霉菌是一种重要工业微生物,能产生大量具有生物活性的天然产物,如广泛应用的、抗肿瘤药及免疫抑制剂,为人类健康和农牧业发展作出了巨大贡献。为了开展链霉菌天然产物挖掘以及高产育种研究,开发高效的基因组编辑技术十分必要。目前,已在链霉菌中开发了基于Ⅱ型CRISPR/Cas系统的基因组编辑工具,其中最为常用的是酿脓链球菌来源CRISPR/SpCas9。然而,由于SpCas9介导的DNA双链断裂对宿主毒性较大,无法适用于DNA转化效率低下的链霉菌。为了解决这一难题,大家主要采用以下2种策略:1)从转录、转录后以及翻译后等不同层次对SpCas9的表达或活性进行调控;2)采用其他细菌来源的Cas9。虽然取得了不错的效果,但它们分别存在操作繁琐与识别位点偏少的问题,限制了它们在链霉菌中的广泛应用。SpCas9突变体nCas9（Cas9,D10A）发挥nickase的功能,仅切割双链DNA的一条链,对宿主细胞毒性低,但仍可诱发高效同源重组修复,已在多种细菌中被开发用于基因组编辑。本研究在模式菌-天蓝色链霉菌中开发了CRISPR/nCas9基因组编辑技术,并应用于DNA转化效率低下的雷帕链霉菌的遗传改造。主要研究结果如下:1)天蓝色链霉菌中CRISPR/nCas9基因组编辑技术的建立与测试。本论文在实验室前期建立的pKCCas9载体的基础上,对SpCas9编码基因进行了突变（D10A）,获得pKCnCas9重组载体。骨架为复制型载体pKC1139,重组载体中除了nCas9基因以外,还含有引导RNA（sgRNA）表达盒和修复模板（HA）的克隆位点。该质粒复制子pSG5对温度敏感,在37℃培养时,链霉菌中的编辑质粒可以被消除,从而可以进行下一轮编辑。首先,选择3个抗生素合成结构基因redL、redW（负责灵菌红素RED合成）与actⅡ-orf4（放线紫红素ACT合成的调控基因）进行nCas9毒性以及基因缺失效率测试;实验中以Cas9介导的编辑作为对照。结果表明,pKCnCas9（表达nCas9）、pKCnCas9-sgRNA（共表达nCas9/sgRNA）以及pKCnCas9-sgRNA/HA（共表达nCas9/sgRNA,并提供修复模板）的接合转移效率均显著高于对应的Cas9对照组,说明nCas9对宿主的毒性低于Cas9。菌落PCR结合DNA测序以及表型分析结果显示,与文献报道的结果类似,Cas9介导的redL、redW以及actⅡ-orf4的缺失效率均达到100%,而nCas9的缺失效率相当,分别为100%、100%以及83%±6%。随后,选择3个抗生素合成基因簇（BGCs）,分别是act（ACT BGC,17 kb）、red（RED BGC,31.6 kb）和cda(Ca2+依赖抗生素CDA BGC,80 kb)进行缺失。与Cas9介导的缺失效率均为100%相比,nCas9的缺失效率相对较低,分别为63%±5%、87%±12%与87%±11%。最后,本研究进行双基因（redL和redW）与双BGCs（cda和red）的同步缺失,Cas9与nCas9介导的编辑效率为43%±6%/47%±11%和0/43%±15%。研究发现,nCas9介导的编辑存在比较严重的部分编辑现象,即阳性编辑细菌与野生型共存的混菌现象,这应是源于单链切割无法发挥反筛作用。混菌现象可以通过传代的方法得到解决,传一代后可以高效率获得纯合子。另外,在双BGC缺失实验中,Cas9编辑质粒pKCCas9-sgRNAcda+red/HA实验组未能长出接合子,而nCas9组则可以长出564±197个接合子,体现了nCas9基因组编辑技术的低毒性优势。2)CRISPR/nCas9编辑技术用于工业菌株-雷帕链霉菌的遗传改造为了探究CRISPR/nCas9是否适用于低DNA转化效率的工业链霉菌的遗传改造,本研究以遗传操作十分困难的雷帕霉素产生菌-雷帕链霉菌2001作为研究对象。选择雷帕霉素合成基因簇内的调控基因rapH、rapRS、rapY进行了分别缺失,Cas9作为对照。结果显示,nCas9介导的缺失效率分别为27.2%±5%、28.9%±0.2%、30%±4%,而且接合子中很少出现混菌现象,这可能与雷帕链霉菌生长缓慢有关,长时间的培养允许细胞有足够时间对nCas9形成DNA缺口进行修复。而Cas9编辑质粒对照组几乎没有长出接合子,无法获得编辑阳性菌株。综上,本研究建立了基于CRISPR/nCas9的链霉菌基因组编辑技术,因其毒性低,可以适用于DNA转化效率低下的链霉菌的遗传改造。该技术的开发增加了CRISPR编辑技术可编辑链霉菌的范围,扩大了遗传操作工具箱。