端粒(telomere)是真核生物染色体线性DNA分子末端的特殊结构，对维持染色体稳定性和DNA完整复制具有重要作用。端粒酶是一种能以自带RNA为模板，逆转录合成端粒DNA并加于染色体末端的核糖核蛋白。端粒酶调节亚单位hTERT对端粒酶活性有限速效应。端粒酶延长端粒重复片段能阻止端粒长度随细胞分裂逐渐缩短，维持染色体稳定，使细胞具有永生化特性。目前研究表明端粒酶不但和机体衰老有关，也可能与恶性肿瘤发生、发展有重大关系。 RNA干扰(RNAinterference，RNAi)作用是生物体内的一种通过双链RNA(double-strandedRNA，dsRNA)分子在mRNA水平上关闭特异性序列的基因表达或使其沉默的过程。目前RNA干扰技术在基因功能分析、抗肿瘤和抗病毒的方面有着十分广泛的应用前景，被Science杂志评为2002年度世界十大科学成就之首。 RNA干扰技术可为基因功能研究提供重要的信息，但这种信息只是“全或无”的。在很多情况下，需要研究基因在不同表达水平上对细胞的影响，因此需要一个可以调控的RNA干扰系统来解决这个问题。Tet-on可诱导性RNAi干扰系统含有可以被tet抑制子(tetrepressor，TR)和四环素调节的Hl/TO启动子。在表达TR的细胞中，启动子被抑制，通过加入四环素或者类似物到培养基中，可以解除抑制作用，从而产生RNA干扰效应。 在本课题中，首先建立了含有可以被tet抑制子TR和四环素调节的Hl/TO启动子的Tet-on可诱导性RNA干扰系统。在此基础上构建针对hTERT的可诱导性RNA干扰系统，建立了可诱导性沉默hTERT的细胞株，并且初步探讨了端粒酶活性下降对TREx-Hela细胞株在细胞增殖和凋亡方面的影响。 本课题建立的可诱导性沉默hTERT的RNA干扰系统，为进一步研究端粒酶与细胞增殖调控之间的关系提供了基础。 第一章构建可诱导性沉默hTERT的重组体 方法：1.根据NCBI提供的Hl启动子序列，设计tet-on四环素诱导性H1启动子，即在Hl启动子的TATA盒两侧加上四环素操作子TetO2，并在合成的序列两端加上SpeI和NcoI的酶切位点。酶切RNAi载体psiRNA-hHlneo，插入tet-on四环素诱导型Hl启动子序列替换原来的Hl启动子。tet-on可诱导性RNAi载体psiRNA-hHl/TOneo构建完成。 2.根据NCBI提供的hTERT基因序列，并对目的序列进行筛选，将选出的序列在NCBI进行BLAST比对，选定3组RNA干扰片段。合成后退火，分别连接到psiRNA-hHl/TOneo中，沉默端粒酶催化亚基hTERT的tet-on可诱导性RNAi载体psiRNA-hHl/TO-hTERTshRNA构建完成。 结果：1.通过酶切鉴定和测序分析，tet-on可诱导性RNAi载体psiRNA-hH1/TOneo启动子序列与设计序列一致。 2.通过酶切鉴定和测序分析，插入psiRNA-hH1/TOneo的3段shDNA序列与设计序列一致。 第二章建立可诱导沉默hTERT的TREx-hela细胞株 以及检测方法：1.将构建好的psiRNA-hHl/TO-hTERTshRNA1，2，3分别转染入表达TR的TREx-hela细胞，用G418筛选阳性细胞克隆。 2.用半定量RT-PCR检测各组细胞hTERT的转录后水平，并对其端粒酶活性进行检测。 结果：1.建立了分别稳定转染psiRNA-hHl/TO-hTERTshRNA1，2，3的TREx-hela细胞株。 2.RT-PCR和端粒酶活性检测结果显示3个细胞株中，未诱导组细胞hTERT的mRNA含量未见下降，端粒酶活性未见降低；而诱导组细胞hTERT的mRNA含量下降，端粒酶活性降低。 第三章hTERT沉默对TREx-hela细胞增殖和凋亡的影响 方法：1.细胞的处理：3组细胞分别设立诱导组和未诱导组，诱导组加1ug/ml四环素诱导。 2.MTT法检测诱导组和未诱导组以及对照组的增殖情况。 3.Hochest33342染色观察不同组细胞的凋亡发生情况。 4.流式细胞仪检测各组细胞的凋亡发生情况。 结果：1.MTT检测结果显示：3个细胞株中未诱导组细胞增殖能力未见明显改变；而诱导组细胞增殖后期有减缓趋势。 2.Hochest33342染色及流式细胞仪检测结果示：各组细胞凋亡率无明显差别。 结论1.构建了具有可被四环素诱导的tet-on可诱导性RNAi载体psiRNA-hHl/TOneo，为可调控的基因沉默研究提供了基础。 2.构建了可诱导性沉默端粒酶催化亚基hTERT的重组体psiRNA-hH1/TO-hTERTshRNA。 3.建立了可诱导性沉默hTERT的TREx-hela细胞株。 4.短期内的端粒酶活性降低后TREx-hela细胞生长增殖有下降趋势，而其凋亡情况则未见明显变化。