生物有机体内的多胺是一类带有正电荷的多聚小分子化合物,常见多胺主要有精胺(Spm)、亚精胺(Spd)和它们的合成前体物质腐胺(Put)。多胺不仅与植物的生长发育、形态发生和逆境胁迫响应有密切的关系,还参与了植物体内的信号转导途径。一氧化氮(NO)是植物体内重要的信号分子介导了多种生理生化过程和防御性响应,在生物与非生物胁迫中,起到了关键作用。已有实验证明,多胺能够诱导植物体内NO的产生,然而产生机理仍不清楚。我们的前期工作表明,大豆子叶节愈伤组织二胺氧化酶可能参与了多胺诱导NO的形成,然而相关证据不充分。本文以“吉林小粒7号”大豆种子为材料,首先培养无菌苗,再用大豆子叶节部分,诱导愈伤组织,再进行液体悬浮培养,获得大豆子叶节愈伤组织悬浮细胞,通过培养原生质体、细胞壁再生等过程,用NO专性荧光探针DAF-FM DA、三种外源多胺(Put、Spd和Spm)、NO供体SNP、NO专性清除剂c PTIO和二胺氧化酶专性抑制剂-氨基胍(AG)孵育,用激光共聚焦扫描电镜技术,研究细胞壁与外源多胺诱导植物组织产生NO的关系。结果表明,三种外源多胺均能诱导大豆愈伤组织悬浮细胞产生NO荧光,在三种多胺处理间,NO荧光强度无明显差异;用多胺和NO专性清除剂c PTIO同时孵育细胞,则可显著减弱细胞的NO荧光强度。有趣的是,若在0.05 m M多胺处理前,用二胺氧化酶(Cu AO)专性抑制剂-氨基胍(AG)孵育,也可明显消弱NO荧光,而此时的Cu AO活性被强烈抑制,暗示Cu AO参与了由多胺诱导的NO形成。Cu AO主要定位于豆科植物的细胞壁。除去细胞壁获得高活力的原生质体,并以此为材料,研究外源多胺对NO产生的作用。在本研究中,用外加1 mg/L 2,4-D和0.5 mg/L KT的km8p培养基,对大豆子叶节愈伤组织悬浮细胞进行继代培养,用含0.1%果胶酶R-10,1%Pectolyase Y-23和2%半纤维素酶的0.5 M甘露醇+CPW悬浮和酶解细胞,经滤网过滤、离心,原生质体再悬浮和21%蔗糖溶液梯度离心后,获得高密度的大豆子叶节愈伤组织原生质体,用FDA对原生质体进行活性检测。选择有活力的原生质,用DAF-FM DA黑暗中孵育后,加载外源多胺PAs(Put、Spd和Spm),结果发现,与正常的悬浮细胞相比,去除细胞壁的原生质体,多胺处理诱导产生的NO荧光强度明显减弱,与此相对应的NO的RFU值明显减少。用km8p+0.4M甘露醇用作液体培养基和MSB作为固体培养基,采用固液混合培养的方法,诱导原生质体细胞壁的再生。用VBL型荧光增白剂指示原生质体细胞壁的生壁过程,检测了在原生质体细胞壁再生过程中,多胺诱导细胞产生NO的荧光变化。结果表明,在原生质体细胞壁再生过程中,随着VBL荧光增白剂指示的细胞壁完整程度的增加,多胺诱导产生的NO荧光也随之增强,NO荧光首先出现在细胞的边缘部分,到7 d后细胞NO荧光达最大值,且此增加的NO荧光,同样可被Cu AO专性抑制剂AG所减弱。上述结果表明,原生质体会消弱多胺对NO产生的诱导作用,这种作用又随原生质体细胞壁的再生过程而被逐渐逆转。一个可能的结论是,细胞壁与多胺诱导NO的产生有联系,且与Cu AO活性有关。该研究对进一步了解多胺氧化酶在多胺诱导NO合成中的作用有重要的理论意义。