研究背景膀胱癌每年共有新发病例43万左右,死亡病例17万左右,现已成为全球泌尿外科收治的主要肿瘤类型,也是我国男性最易罹患的泌尿系统肿瘤。流行病学调查研究表明,近年来膀胱癌年轻患者的数量与日俱增,进一步加重了社会负担。膀胱癌按照是否浸润肌层可细分为:非肌层浸润性膀胱癌和肌层浸润性膀胱癌。前者预后较好,但极易复发,因此需要长期随访;后者较易转移,预后较差,若未及时接受治疗,2年内的死亡率高达85%左右。手术切除膀胱肿瘤辅以化疗、免疫治疗是当前治疗膀胱癌的主要手段。近年来,免疫检查点阻断治疗成功运用于多种癌症,有望彻底改变传统癌症治疗方向,因而成为了癌症治疗的里程碑。然而,尽管目前癌症的治疗手段日新月异,但膀胱癌近30年的生存率仍无改善。究其原因,首先是膀胱癌具有高度异质性,这一特性会降低传统治疗的普适性,让即便分级分期相同的病人,预后也存在差异;其次,因非肌层浸润性膀胱癌易复发,应长期随访以动态了解患者疾病进展。然而,长期的反复随访会增加患者经济负担,同时给患者生活与工作造成了诸多不便,故而非肌层浸润性膀胱癌患者依从性较差。有数据表明,只有不到0.02%的高级别非肌层浸润性膀胱癌患者根据医嘱接受规范的治疗。此外,膀胱癌组织的T分期依赖于手术切除的组织样本质量,而T1和T2期时常难以区分,故将会严重影响治疗选择和疗效。因此,对膀胱癌发生、进展机制进行深入研究,寻找有效的预后生物标志物或具有临床价值的治疗靶点将有益于膀胱癌的早期发现、及时治疗以及个性化治疗。不受控制的细胞增殖和转移是肿瘤的主要特征。DNA复制、转录、修复和重组是细胞增殖的关键步骤。生命体可以通过改变核小体的位置和局部密度进行染色质重塑对这些环节进行调控。酵母交配型转换/蔗糖不发酵（yeast switch in mating type/sucrose non fermentation,SWI/SNF）复合体在酿酒酵母研究中首次发现,该复合体在不同生物之间保持着极高的保守性。在哺乳动物体内,SWI/SNF蛋白复合体是由29个基因编码的蛋白亚基所组成。SNF5是SWI/SNF蛋白复合体的核心亚基,它在95%高侵袭性横纹肌肉瘤中发生突变或缺失。过往有研究报道证实,SNF5与c-MYC相互作用参与到细胞增殖和细胞周期调控。在肿瘤转移方面,横纹肌肉瘤细胞中SNF5可以通过上调Rho A进而调节肌动应力纤维和细胞运动。此外,在髓性白血病中,SNF5下调可以激活Rac GTP酶促进细胞迁移。但目前SNF5在膀胱癌中的作用及机制未见报道。目的探索SNF5分子在膀胱癌中的表达模式以及它在膀胱癌进展中发挥的作用,并探究相应的分子机制。通过解析SNF5在膀胱癌生物特征中扮演的角色,进一步深入理解膀胱癌进展的分子机制,同时也为寻找膀胱癌化疗生物标志物以及治疗新靶点,为膀胱癌个性化治疗提供一定的实验基础。方法1.通过检索TCGA数据库和GEO数据库GSE13507、GSE121711芯片对SNF5在膀胱癌和癌旁组织中的m RNA表达水平进行分析;使用数据集TCGA-BLCA进行生存分析,运用R包“survival”和“survminer”根据膀胱癌患者中SNF5表达水平分为相对高表达组和相对低表达组,探讨两组患者生存时间;结合膀胱癌患者临床特征,分析SNF5表达水平在不同临床分期、分级、T分期、N分期以及M分期膀胱癌组织中差异,并运用在膀胱癌细胞系和正常尿路上皮细胞系进行SNF5表达水平进行分析;此外,对我院157例膀胱癌患者组织进行免疫组织化学染色法检测SNF5分子的表达,通过运用R语言软件计算其最优截断值,并据此分为SNF5相对高表达组和相对低表达组,对两组患者SNF5表达水平与年龄、性别以及肌层浸润等进行分析。2.构建SNF5敲减5637、T24细胞系和SNF5过表达T24细胞系;采用CCK-8和克隆形成实验检测对照细胞与敲减SNF5细胞的增殖差异;其次,将正常细胞与敲减SNF5细胞对裸鼠皮下进行移植瘤实验,并对各组瘤体大小、重量进行记录,运用免疫组织化学染色检测各组Ki67和Cleaved caspase 3的表达变化;再次,通过基因集富集分析（gene set enrichment analysis,GSEA）分析上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）在SNF5各组中的富集情况,并采用划痕和Transwell实验检测各组细胞的迁移情况,采用Western blotting检测EMT相关的分子标志物的表达;最后,对T24的SNF5过表达细胞系通过CCK-8、克隆形成、划痕和Transwell实验检测其增殖和迁移情况。3.通过GSEA分析SNF5低表达膀胱癌组织中富集的信号通路;其次,分别采用Western blotting和免疫组织化学染色法对SNF5敲减细胞及瘤体中检测STAT3及磷酸化STAT3（Y705）的变化,并使用STAT3的抑制剂S3I-201通过克隆形成和Transwell实验,对SNF5下调诱导的促增殖、促迁移效应是否由STAT3（Y705）磷酸化导致进行验证。4.通过抗癌药物敏感性基因组学数据库（Genomics of Drug Sensitibity in Cancer,GDSC）建立相关化疗药物IC50预测模型,基于SNF5表达水平筛选出AKT inhibitor VIII、AZD0530以及吉非替尼（Gefitinib）三种药物,细胞层面比较SNF5低表达组和高表达组在不同药物IC50以确定药物敏感性,并采用EZH2抑制剂GSK126处理sh SNF5组和sh NC组的T24与5637细胞,并观察其对顺铂耐药性的影响。结果1.TCGA和GEO数据库结果显示,膀胱癌组织中SNF5表达水平较正常组织显著上调;在癌与癌旁配对组织的比较中,膀胱癌组织中SNF5表达水平显著上调。在对人种、性别、年龄以及不同AJCC分期的进一步分层分析中,与正常组织比较,SNF5表达水平在膀胱癌组织中显著高表达。在TCGA-BLCA数据集和GSE13507数据集中,与SNF5相对高表达患者相比,SNF5相对低表达患者生存时间显著缩短。在m RNA水平上,通过分析TCGA公共数据库的RNA测序数据以及膀胱癌患者的临床病理信息发现,发生淋巴结转移的膀胱癌患者较未发生淋巴结转移者,SNF5表达水平显著下调;在CCLE数据库分析中发现,具有转移性膀胱癌细胞253J-BV和253J细胞系SNF5表达水平相对较低。在m RNA和蛋白水平上,采用膀胱癌细胞系检测到分级较高的T24细胞（Grade III）SNF5蛋白表达水平显著低于较低较级别的5637细胞（Grade II）。在临床组织层面,对本院队列的临床标本和临床病理特征进行相关性分析发现,SNF5蛋白表达水平与淋巴结密切相关。2.SNF5敲减可以促进膀胱癌细胞增殖以及增强细胞迁移。与对照组相比,T24SNF5敲减组细胞和5637 SNF5敲减组细胞增殖速率显著加快,克隆形成数目显著增多。裸鼠皮下移植瘤实验结果表明,T24和5637细胞SNF5表达水平下调后,肿瘤的生长速度显著加快。T24和5637细胞SNF5敲减组的瘤体重量显著大于对照组瘤体重量。瘤体的免疫组化染色显示,T24敲减组和5637敲减组细胞来源的瘤体较其对照组瘤体,Ki-67表达显著上调,而cleaved caspase-3表达水平无差异。在GSEA分析中,上皮-间质转化相关基因集在SNF5低表达患者中富集。划痕实验结果提示T24细胞和5637细胞SNF5表达水平下调后,细胞迁移的速度显著加快。Transwell实验结果显示,T24细胞和5637细胞SNF5敲减后,迁移的膀胱癌细胞数量显著增多。Western blotting结果表明,与对照组比较,T24细胞和5637细胞SNF5表达水平下调后,波形纤维蛋白（Vimentin）、Snail蛋白表达水平显著上调,而E钙粘蛋白（E-cadherin）表达水平显著下调。而T24细胞在SNF5过表达后,与对照组比较,未观察到细胞增殖、细胞迁移显著变化。3.SNF5敲减是通过激活STAT3促进膀胱癌细胞增殖、细胞迁移。GSEA分析结果提示,JAK/STAT信号通路在SNF5低表达组富集。Western blotting检测T24细胞和5637细胞敲减组和对照组的STAT3表达水平无显著变化,但敲减组p-STAT3（Y705）表达水平显著上调,提示SNF5敲减导致STAT3磷酸化。相似地,相对对照组瘤体,T24敲减组细胞和5637敲减组细胞来源的瘤体中也检测到了显著上调的p-STAT3（Y705）。STAT3的抑制剂S3I-201处理后,SNF5敲减组促细胞增殖、促细胞迁移的效应显著减弱。4.借助化疗药物IC50预测模型发现,SNF5低表达患者在膀胱癌化疗药物（顺铂、吉西他滨、多柔比星、丝裂霉素C）的IC50值高于SNF5高表达组患者;而在AKT inhibitor VIII、AZD0530以及吉非替尼中,SNF5低表达组患者IC50显著低于SNF5高表达组患者IC50。药敏实验发现T24细胞和5637细胞在SNF5敲减后,对吉非替尼（gefitinib）敏感性显著提高;EZH2抑制剂可以抑制SNF5敲减组膀胱癌细胞对顺铂的耐药性。结论本研究明确了SNF5在膀胱癌中表达水平较正常组织显著上调;SNF5低表达与膀胱癌患者不良预后密切相关;这可能与SNF5在膀胱癌中表达下调可激活STAT3进而促进细胞增殖、迁移有关。此外,吉非替尼或EZH2抑制剂联合顺铂有成为SNF5低表达患者个体化治疗方案的潜能。