论文部分内容阅读
二化螟Chilo suppressalis (Walker)是水稻上的主要害虫之一,在我国从南到北均有分布,对环境温度有很强的适应性。本文通过研究与二化螟热胁迫耐受性密切相关的热休克蛋白(HSPs),检测热胁迫下二化螟幼虫血淋巴细胞内活性氧(ROS)的变化及其对血淋巴细胞凋亡的影响,比较二化螟幼虫体内保护酶(SOD、CAT、POD和GSH-px)的活性,分析机体应对氧化应激的保护机制,探讨二化螟幼虫对热胁迫耐受的适应机理。研究主要结果如下：(1)采用RT-PCR及RACE技术从二化螟血淋巴细胞中分别克隆了热休克蛋白60和热休克蛋白70基因全长cDNA序列。HSP60基因全长2142bp,开放阅读框为1719bp,编码572个氨基酸；5’和3’非编码区分别为158bp和265bp。HSP70基因全长2102bp,开放阅读框为1959bp,编码652个氨基酸；5’和3’非编码区分别为81bp和62bp。同源性分析表明,二化螟HSP60和HSP70基因与其它昆虫的HSP60和HSP70基因有很高的相似性。此外,还克隆了二化螟18sRNA基因全长,以其作为实时定量PCR的内标。(2)为了研究二化螟热休克蛋白的转录表达,采用实时定量PCR方法,对不同温度热胁迫下的二化螟幼虫血淋巴细胞内的HSP60、HSP70和HSP90基因转录表达情况进行分析。试验结果表明,热胁迫能显著诱导二化螟热休克蛋白基因表达。热休克蛋白基因表达量与热激强度密切相关,其中HSP60基因在36-39℃时表达量最高,HSP70基因表达量最高出现在33-36℃,HSP90基因表达量在33-39℃没有显著变化。(3)首次将流式细胞技术(flow cytometry,FCM)引入昆虫血淋巴细胞热休克蛋白表达的研究。试验结果表明,热胁迫显著诱导二化螟幼虫血淋巴细胞内热休克蛋白60、70和90的表达,与在mRNA水平上的表达变化高度一致,说明二化螟幼虫热休克蛋白在转录及翻译水平上受到热应激的调节。(4)通过测定热胁迫下二化螟幼虫血淋巴细胞内活性氧水平、对血淋巴细胞凋亡的影响及体内保护酶的活性,分析各种保护酶与热休克蛋白表达的协调作用,探讨了二化螟幼虫体内生理上的保护反应。在本研究中,热胁迫引起二化螟幼虫体内产生氧化应激反应,导致血淋巴细胞内ROS大量产生,同时诱导热休克蛋白水平显著提高,但是热胁迫处理并没有导致幼虫血淋巴细胞凋亡的显著变化,表明机体的两种抗氧化系统(热休克蛋白和抗氧化酶)协同作用,有效地消除了热胁迫引起的氧化应激对幼虫血淋巴细胞的伤害。