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研究背景及目的细颗粒物质（PM2.5）表示大气空气动力学当量直径小于或等于2.5微米的颗粒。人体长期或短期接触PM2.5会直接威胁身体健康。大量文献已报道PM2.5与呼吸系统疾病、心血管疾病密切相关。机体长期暴露于PM2.5空气环境中会增加人体患哮喘的风险并加重哮喘症状。PM2.5会诱发气道上皮细胞粘液产生,促进呼吸道上皮细胞发生炎症。有研究指出PM2.5是人支气管平滑肌细胞迁移所必需的细颗粒物质,因而表明PM2.5在慢性阻塞性肺病的气道重塑中有着一定的作用。此外,PM2.5与ApoE-/-小鼠的动脉粥样硬化病情进展也有一定的相关性。众多文献证实,PM2.5与癌症的发病率具有显著相关性。相关证据表明在欧洲国家中,空气污染提高了绝经后妇女乳腺癌的发病率。在美国,环境中过量的PM2.5暴露可能是肝癌发生的危险因素。此外,PM2.5也参与了肺癌的进展。将人非小细胞型肺癌细胞暴露于PM2.5环境中,促进了肺癌细胞的运动能力和增殖能力。PM2.5也会诱发人肺癌细胞的上皮间质转化。此外,肺癌干细胞的相关特性由PM2.5诱导而来。但是,PM2.5的长期暴露与肺癌之间的确切关系尚未清楚,因此,阐明PM2.5与肺癌的关系对于肺癌的临床治疗具有重要意义。外泌体是直径介于30-150 nm的微小囊泡,富含内体衍生组分。外泌体具有脂质双分子层结构,包含可溶性蛋白质,RNA和DNA等。越来越多的证据表明外泌体作为信使调节不同细胞之间的交流作用。肿瘤来源的外泌体（Tumor-derived exosomes,TEXs）与肿瘤发展密切相关。TEXs 上的 HSP72、HSP105蛋白与树突状细胞表面TLR2、TLR4受体结合,促进树突状细胞释放大量炎性因子,从而促进肿瘤的转移。在胰腺导管腺癌中,TEXs上的LNC-Sox2ot通过充当ceRNA来促进上皮间充质化和干性化。TEXs上的RNAs激活支气管肺泡上皮细胞TLR3受体而募集中性粒细胞,因而促进肺转移前肿瘤微环境的形成。一方面,有研究指出肿瘤相关成纤维细胞Wnt1Ob蛋白促进乳腺癌细胞转移。另一方面,PM2.5诱导的大鼠肺动脉高压中Wrnt信号通路被激活。而针对PM2.5刺激的肺癌细胞来源的外泌体是否可通过激活Wnt信号传导影响肺癌肿瘤进展,迄今尚无文献报道。因此,本研究拟利用体外刺激以及体内A549肺腺癌皮下肿瘤模型,探讨PM2.5刺激后A549细胞来源的外泌体对肺癌生长的调控及其相关分子机制。研究方法与结果1.PM2.5处理后A549肺腺癌细胞来源的外泌体携带更多的Wnt3a蛋白。为明确PM2.5处理后的A549肺腺癌细胞中Wnt蛋白家族的表达情况,我们首先利用PM2.5体外刺激A549肺腺癌细胞。Real-time PCR与WB结果表明,与正常A549肺腺癌细胞相比较,PM2.5刺激后的A549肺腺癌细胞中Wnt3a表达水平明显上升,而Wnt1、Wnt4、Wnt7a、Wnt9a、Wnt9b和Wnt1Ob的含量在两组间无差异。同时,PM2.5处理后的人支气管上皮细胞HBE的Wnt3a表达也增加。为进一步明确PM2.5处理后A549肺腺癌细胞来源的外泌体中Wnt3a蛋白的表达情况,收集PM2.5处理和不处理的A549来源的外泌体（EXOPM2.5和EXOCtrl）,采用电镜、纳米颗粒分析仪和蛋白印迹技术（western blotting,WB）鉴定并分析上述外泌体。结果表明,PM2.5的刺激对外泌体的形态无影响,而EXOPM2.5比EXOCtrl携带更多的Wnt3a蛋白水平。2.PM2.5处理后A549肺腺癌细胞来源的外泌体诱导A549肺腺癌细胞中β-catenin通路的活化。β-catenin是Wnt信号通路中关键下游效应分子,在肿瘤细胞的增殖过程中发挥重要作用。PM2.5能上调EXOPM2.5中Wnt3a的蛋白水平,因此,我们推测EXOPM2.5很有可能活化A549细胞中的β-catenin信号通路,从而影响肺癌细胞的增殖。为探讨EXOPM2.5是否可以活化A549肺腺癌细胞中β-catenin通路,我们利用WB和免疫荧光检测EXOPM2.5处理与不处理的A549肺腺癌细胞中β-catenin通路的活化情况。结果表明,与EXOCtrl处理组A549肺腺癌细胞相比较,EXOPM2.5刺激组A549肺腺癌细胞中β-catenin蛋白表达增加,β-catenin蛋白入核也显著增加。以上结果表明,EXOPM2.5能够激活A549肺腺癌细胞中β-catenin信号通路。3.PM2.5处理后A549肺腺癌细胞来源的外泌体不影响A549肺腺癌细胞的迁移和侵袭能力Wnt/β-catenin信号通路与肿瘤细胞的迁移和侵袭有着密切的关系,为明确EXOPM2.5是否会影响A549肺腺癌细胞的迁移和侵袭能力。我们将EXOCtrl和EXOPM2.5刺激的A549肺腺癌细胞进行体外迁移和侵袭实验。结果显示,两组A549肺腺癌细胞的迁移能力无明显差异,两组A549肺腺癌细胞的侵袭能力也无明显差异。以上结果表明,EXOPM2.5不影响A549肺腺癌细胞的迁移和侵袭能力。4.PM2.5处理后A549肺腺癌细胞来源的外泌体通过Wnt3a/β-catenin信号通路影响A549肺腺癌细胞的体外增殖能力由于β-catenin信号通路促进肿瘤细胞增殖,我们进一步检测了 EXOPM2.5对A549细胞增殖能力的影响。通过CCK-8检测手段,我们发现,与EXOCtrl刺激组A549肺腺癌细胞相比较,EXOPM2.5处理组A549肺腺癌细胞的增殖能力明显增强。为了明确Wnt3a蛋白在EXOPM2.5增加A549肺腺癌细胞增殖过程中的作用,我们采用siRNA技术将A549肺腺癌细胞的Wnt3a蛋白敲低。CCK-8实验结果表明,与PBS对照处理的A549肺腺癌细胞相比较,来自negative control（NC）siRNA转染的经PM2.5处理的A549细胞来源的外泌体（EXOPM2.5/NC siRNA）仍能促进A549肺腺癌细胞的增殖,而来自Wnt3a siRNA转染的经PM2.5处理的A549细胞来源的外泌体（EXOPM2.5/Wnt3a siRNA）促进A549肺腺癌细胞的增殖能力消失。这一结果表明,EXOPM2.5促进A549细胞增殖依赖于Wnt3a。为了进一步明确Wnt/β-catenin信号通路在EXOPM2.5增加A549肺腺癌细胞增殖过程中的作用,我们应用了 β-catenin信号通路特异性抑制剂（LF3）。结果显示,与DMSO对照处理的A549肺腺癌细胞相比较,EXOPM2.5+DMSO处理的A549肺腺癌细胞的增殖能力明显增加,而EXOPM2.5+LF3处理的A549肺腺癌细胞的增殖能力无明显化。上述实验结果表明,EXOPM2.5提高A549肺腺癌细胞的增殖能力是依赖于Wnt3a/β-catenin 信号通路。5.PM2.5处理后A549肺腺癌细胞来源的外泌体通过Wnt3a/β-catenin信号通路影响A549肺腺癌细胞的体内增殖能力为探讨EXOPM2.5是否可在体内促进A549肺腺癌细胞的增殖,我们采用裸鼠构建A549肺腺癌细胞皮下肿瘤模型,记录荷瘤裸鼠肿瘤大小以及荷瘤裸鼠生存率,采用免疫组化检测肿瘤组织增殖指示蛋白Ki67和β-catenin的表达情况。结果表明,与PBS或EXOCtrl处理组的荷瘤裸鼠相比较,EXOPM2.5处理组的裸鼠肿瘤明显较大,生存率显著缩短,肿瘤组织Ki67免疫组化染色显示EXOPM2.5促进A549肺腺癌细胞内Ki67蛋白的表达水平,同时也促进肿瘤组织β-catenin的表达。上述实验结果表明EXOPM2.5很可能通过增加β-catenin的积累促进A549肺腺癌细胞的体内增殖能力。为进一步明确Wnt3a蛋白在EXOPM2.5增加A549肺腺癌细胞体内增殖过程中的作用。我们采用裸鼠构建A549肺腺癌细胞皮下肿瘤模型,注射PBS、EXOPM2.5/NC siRNA或EXOPM2.5/Wnt3a siRNA,定期观察荷瘤裸鼠肿瘤大小以及荷瘤裸鼠生存率,裸鼠肿瘤组织免疫组化染色Ki67和β-catenin表达情况。结果表明,与PBS组裸鼠相比较,EXOPM2.5/NC siRNA组裸鼠的肿瘤明显增大,生存率明显缩短;EXOPM2.5/Wnt3a siRNA组裸鼠的肿瘤大小和生存率无变化。同时,肿瘤组织Ki67和β-catenin免疫组化染色也显示出与上述一致的变化趋势。以上结果证实,EXOPM2.5促进A549肺腺癌细胞肿瘤体内生长依赖于Wnt3/β-catenin 信号通路。研究结论PM2.5刺激A549肺腺癌细胞后,其分泌的外泌体携带更多的Wnt3a蛋白,而后该外泌体通过Wnt3a增加A549肺腺癌细胞β-catenin蛋白水平并促进β-catenin入核,促进其转录活化,最终加速了肺癌生长。创新性及研究意义本研究首次报道了 PM2.5作用后的A549肺腺癌细胞来源的外泌体富含Wnt3a蛋白,发现EXOPM2.5中Wnt3a蛋白活化A549肺腺癌细胞β-catenin信号通路,促进肺癌生长。上述研究结果不仅有助于阐明环境污染与肺癌的关系,并且为肺癌的治疗提供了新靶点。