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多溴联苯醚(Polybrominated Diphenyl Ethers,PBDEs)是一类广泛使用的溴代阻燃剂。由于其热稳定性好,阻燃效率高,目前已被广泛应用于纺织、家具、建材和电子等潜在可燃产品当中。自20世纪70年代生产和使用多溴联苯醚至今,已造成全球性环境污染。环境流行病学资料调查显示,PBDEs广泛存在于各种环境介质中,并可以通过消化道、呼吸道和皮肤等途径进入机体。在人体血液、乳汁和脂肪等组织中均可以检测出PBDEs的存在。PBDEs具有难降解性、环境稳定性、高脂溶性和生物放大作用等特点,能够通过食物链的转移,使生物受到毒害,最终导致对人体健康的危害。研究发现,多溴联苯醚对试验动物有致癌性、生殖毒性、神经发育毒性和内分泌干扰毒性,作用的靶器官主要包括神经系统、脂肪组织、甲状腺和生殖系统等。因此,在美国及欧洲等地,相继限制生产和使用低溴类如BDE-47；99；153等,但高溴类BDE-209因其阻燃性能好,其生物毒性不确定而仍在广泛使用。BDE209在环境中极易发生脱溴反应,生成低溴类化合物,其危害依然不容忽视。因此,本研究选取BDE-47和BDE209为代表性多溴联苯醚类化合物,利用体外培养小鼠睾丸间质瘤细胞株(MLTC-1)和小鼠胚胎干细胞系(D3)为染毒模型,侧重于研究多溴联苯醚类化合物对类固醇激素合成的影响,以及对胚胎干细胞的细胞毒性和全能性维持的影响,并初步探讨了其相关分子机制。第一部分BDE-47/BDE-209对类固醇激素合成的影响及相关分子机制目的观察BDE-47/BDE-209对类固醇激素合成的影响,初步探讨cAMP-PKA信号通路在多溴联苯醚抑制孕酮合成中的作用。方法1.采用体外培养的小鼠睾丸间质瘤细胞株(MLTC-1)作为染毒模型。2.MTT法测定BDE-47/BDE-209对MLTC-1细胞活力的影响,确定染毒剂量。3.不同浓度BDE-47/BDE-209染毒MLTC-124h,在培养液中加入hCG(O.1U/L)继续染毒4h,用放射免疫法(RIA)检测培养液上清中的孕酮水平。4.不同浓度BDE-47/BDE-209染毒MLTC-124h,吸弃培养液,继续用不含BDE-47/BDE-209的培养液培养24h后,培养液中加入hCG继续培养4h, RIA检测培养液上清中的孕酮水平。5.不同浓度BDE-47/BDE-209染毒MLTC-1细胞24h,培养液中分别加入CT (30ng/ml)、forskolin (10μmol/L)和hCG (0.1U/L)继续染毒4h,RIA法检测细胞培养上清中的孕酮和cAMP水平。6.不同浓度BDE-47/BDE-209染毒MLTC-1细胞24h,培养液中分别加入8-Br-cAMP (500nmol/L)、22R-HC(25μmol/L)和孕烯醇酮(10μmol/L)继续染毒4h,RIA法检测细胞培养上清中的孕酮水平。7. Real-time PCR法测定类固醇激素合成急性调节蛋白(StAR)、胆固醇侧链裂解酶(P450scc)、3β-HSD mRNA表达水平的变化。8.蛋白印迹法(western blot)测定StAR、P450scc、3β-HSD蛋白表达水平的变化。结果1.根据MTT结果确定BDE-47及BDE-209染毒剂量均分别为：0、0.04、0.2、1、5和25μmol/L2.在hCG刺激下,BDE-47显著抑制孕酮的合成,且呈剂量一反应关系。在25μmol/L组,孕酮下降了87.6%。相较而言,BDE209对孕酮合成的抑制作用较弱,仅在25μmol/L组出现显著性差异。3.去除化学物继续培养24h后,BDE-47/BDE-209各剂量组的孕酮水平均无显著性差异。4.在forskolin刺激下,BDE-47和BDE-209均显著抑制孕酮的合成,但在CT刺激下,BDE-47和BDE-209各剂量组的孕酮水平均无显著差异。5.在hCG和forskolin刺激下,BDE-47显著抑制MLTC-1细胞内cAMP水平。但在CT的刺激下,这种抑制作用消失。而BDE-209处理组,hCG、forskolin、CT刺激下,细胞内cAMP水平均无明显改变。6.培养液中加入8-Br-cAMP后,BDE-47和BDE-209仍抑制孕酮的合成。7.在培养液中加入22R-HC和孕烯醇酮后,BDE-47显著抑制二者刺激下的孕酮合成；但对于BDE-209处理组,未发现该抑制效应。8. BDE-47/BDE-209染毒MLTC-1细胞24h后,StAR mRNA和蛋白水平均无显著变化。9.BDE-47染毒MLTC-1细胞24h后,P450scc mRNA和蛋白水平均呈剂量-反应关系下降,而3β-HSD仅观察到mRNA水平下降,蛋白水平没有明显改变。BDE-209处理组,仅观察到P450scc和3β-HSD mRNA水平下降,未观察到其蛋白水平下降。结论1、BDE-47显著抑制MLTC-1类固醇激素的合成,去除化学物后MLTC-1细胞合成类固醇激素的能力基本恢复。BDE-47显著抑制MLTC-1细胞孕酮的合成,其机制可能涉及cAMP-依赖的蛋白激酶信号通路。此外,BDE-47还抑制P450scc和3β-HSD酶的活性及表达水平。2、BDE-209抑制MLTC-1类固醇激素的合成,去除化学物后MLTC-1细胞合成类固醇激素的能力基本恢复。BDE-209对MLTC-1细胞孕酮合成的影响,并不涉及cAMP-依赖的蛋白激酶信号通路,但是可以抑制P450scc的mRNA转录。3、BDE-47与BDE-209相比,对类固醇激素合成的影响更显著。第二部分BDE一47对小鼠胚胎干细胞的毒性研究及相关分子机制目的观察BDE-47对小鼠胚胎干细胞的毒性作用及对干细胞全能性维持的影响,并初步探讨相关分子机制。方法1.采用体外培养的D3mESCs作为染毒模型。2.不同浓度BDE-47染毒D3mESCs24h和48h,观察细胞形态改变。3.不同浓度BDE-47染毒D3mESCs24h和48h, MTT法测定BDE-47对D3mESCs细胞活力的影响,确定后续试验染毒剂量。4.不同浓度BDE-47染毒D3mESCs24h,利用流式细胞仪分析细胞周期改变。5.不同浓度BDE-47染毒D3mESCs24h,利用流式细胞仪和DeadEndTM荧光测定TUNEL系统检测细胞凋亡情况。Real-time RT-PCR测定促凋亡基因P53的表达水平变化。6.不同浓度BDE-47染毒D3mESCs24h,用碱性磷酸酶染色试剂盒检测染毒后的D3mESCs的染色状况；用碱性磷酸酶活性分析试剂盒检测染毒后的D3mESCs碱性磷酸酶活性改变。7.不同浓度BDE-47染毒D3mESCs24h,固定细胞后,用细胞免疫荧光法检测染毒后的D3mESCs的转录因子Oct-4/Sox-2/Nanog表达情况。8. Real-time RT-PCR测定不同浓度BDE-47染毒后转录因子Oct-4/Sox-2/Nanog的表达水平变化以及mmu-miR-145和mmu-miR-34a的表达情况。9.蛋白印迹法(western blot)测定Oct-4/Sox-2/Nanog蛋白表达水平的变化。结果1.不同剂量BDE47染毒24h和48h后,D3mESCs的细胞形态与对照组比较,均在25μM剂量组及以上出现改变,镜下观察细胞密度明显减少,少数细胞碎裂,细胞出现明显萎缩,部分克隆边缘塌陷。而且染毒48h, D3mESCs细胞形态改变更加明显。2.MTT结果显示,不同剂量BDE47染毒24h后,D3mESCs各剂量组细胞活力无明显差异。不同剂量BDE47染毒48h后,100gM剂量组出现细胞活力改变,细胞存活率降低。确定后续试验染毒剂量为0.04μM,1μM,25μM，100μM；染毒时间为24h。3.流式细胞周期结果显示,不同剂量BDE47染毒24h后,D3mESCs细胞周期各期水平无显著性差异。4.流式细胞凋亡结果显示,不同剂量BDE47染毒24h后,在25μM及100μM剂量组,D3mESCs细胞凋亡增加,统计具有显著差异(P<0.05).DeadEndTM荧光测定TUNEL系统原位分析细胞凋亡结果显示,随着染毒剂量增加,细胞内凋亡信号增加,凋亡细胞显著增加。5.AP染色结果显示,不同剂量BDE47染毒24h后,D3mESCs在1μM及以上剂量组出现细胞着色减淡,部分细胞未着色。AP活性检测结果显示,D3mESCs在1μM剂量组即出现AP活性的显著下降。6.细胞免疫荧光结果显示,不同剂量BDE47染毒24h后,D3mESCs维持其干细胞多能性的转录因子Oct-4、Sox-2,Nanog表达降低。7.不同剂量BDE47染毒24h后,D3mESCs维持其干细胞多能性的转录因子Oct-4、Sox-2,Nanog mRNA和蛋白水平均呈剂量-效应关系下降；而MircoRNA mmu-miR-145和mmu-miR-34a水平呈剂量-效应关系上升。结论1、BDE-47能引起D3mESCs细胞形态改变。染毒48h后,在100gM剂量组引起细胞活力显著降低。BDE47能导致细胞凋亡增加,促凋亡基因P53表达升高。2、BDE-47能影响D3mESCs全能性的维持,显著抑制D3mESCs维持全能性的转录因子Oct-4.Sox-2,Nanog的表达,其机制可能涉及促进相关MicroRNA mmu-miR-145和mmu-miR-34a的高表达。