结直肠癌(Colorectal cancer,CRC),也叫大肠癌,是临床上常见的消化道恶性肿瘤,其发生通常与饮食改变和环境因素有关,发病率和死亡率均偏高。据2018年全球185个国家癌症数据统计,结直肠癌发病率和病死率皆居全球前三位。临床上结直肠癌治疗方式仍以手术治疗、放疗、化疗为主。其中常见的化疗药物氟尿嘧啶、伊立替康、奥利沙铂等具有可预测肝毒性。因此开发一种高效低毒的结直肠癌治疗药物迫在眉睫。DNA存储着生物体赖以生存和繁衍的遗传信息,对细胞至关重要,因此维护DNA分子的完整性是基础。当癌细胞受到代谢过程产生的活性氧或化学物质、辐射等外界因素的损害时,易诱导基因复制异常,如果基因复制异常且不加以修复,可能会损害基因组的完整性,导致基因突变。DNA损伤类型包括点突变、缺失、插入、倒位或转位、双键断裂。当DNA双键断裂时,共济失调毛细血管扩张突变蛋白ATM将会识别其断裂点,并通过其自身Ser1981磷酸化传递DNA损伤信号,细胞DNA上调修复通路相关蛋白并启动DNA修复。细胞周期调控蛋白分子级联调节周期进程,细胞周期阻滞,有丝分裂停止,阻止受损的DNA信息进一步扩大。植物激素白藜芦醇在抗肿瘤、抗炎、抗氧化损伤等方面表现出显著药理活性。其中白藜芦醇主要通过诱导癌细胞发生凋亡、坏死、自噬、周期阻滞等发挥抗肿瘤活性。在前期 的研究 过程中,我们 发现 白 藜芦醇类似化 合物(E)-3-((4-methoxyphenylimino)methyl)benzene-1,2-diol(MMB)在体内外显著抑制结直肠癌生长,具有潜在的药用开发价值。因此,本课题从凋亡、坏死、铁死亡、周期、DNA损伤、自噬等几个方面研究MMB阻滞结直肠癌的机制。本课题所有内容均为首次研究,所得结果将为结直肠癌治疗和白藜芦醇类似物的新药研发提供新的选择与参考。本课题分别在体内外探究MMB对结直肠癌生长的抑制作用,并深入研究MMB对结直肠癌细胞凋亡、自噬、DNA损伤以及细胞周期阻滞的影响从而确定MMB抑制结直肠癌细胞生长的确切药理机制。我们将通过以下几种方法进行课题研究:1.应用MTT法、平板克隆-结晶紫染色法确定MMB在细胞水平上抑制结直肠癌细胞活力;2.通过体重变化、脏器系数、组织染色、血生化分析确定MMB干预对健康裸鼠的毒性;3.应用皮下注射方法建立结直肠癌裸鼠荷瘤模型,通过体重变化、瘤体积和瘤重变化、脏器系数考证MMB干预对结直肠癌组织生长的抑制作用;4.应用Annexin V-FITC/PI双染法确定MMB干预对结直肠癌细胞凋亡的影响,并进一步分别应用铁死亡、坏死、凋亡等小分子抑制剂探究MMB对铁死亡、坏死、凋亡的影响;5.分别应用PI染色、Western blot、RT-PCR、ATM和WEE1小分子抑制剂干预等方法确定MMB干预对ATM介导的周期阻滞信号通路的影响。我们得出以下研究结果:1.MMB体外显著抑制结直肠癌细胞系DLD-1、SW480、HCT116细胞活力我们通过MTT法研究MMB分别在0,6.25,12.5,25,50,100,200 μM浓度下干预三种结直肠癌细胞48 h后对细胞活力的影响,并计算MMB对DLD-1、SW480、HCT116细胞的IC50分别为52.61、74.20、59.95。平板克隆形成实验进一步证实MMB显著抑制结直肠癌细胞活力;2.MMB对健康裸鼠无显著毒性选取BALB/C Nude雌性裸鼠作为实验动物。经尾静脉注射1mg/kg/3d剂量的MMB治疗21 d,研究MMB在体内对健康裸鼠毒性作用。结果显示,与生理盐水对照组相比,MMB干预未明显影响裸鼠体重,谷丙转氨酶、谷草转氨酶、肌酐、尿素氮测定结果无显著性差异,心、肝、脾、肺、肾脏器系数及组织切片HE染色无显著性差异。以上结果表明,MMB对健康裸鼠无显著毒性;3.MMB显著抑制结直肠癌荷瘤组织生长选取BALB/C Nude雌性裸鼠作为实验动物。建立皮下荷瘤模型,经尾静脉注射1 mg/kg/3d剂量的MMB治疗21 d,研究MMB体内对荷瘤裸鼠组织生长的作用。荷瘤实验结果表明,与生理盐水对照组相比,MMB干预未明显影响裸鼠体重,心、肝、脾、肺、肾脏器系数无显著性差异,裸鼠荷瘤体积和质量均显著降低,肿瘤组织切片HE染色结果表明MMB干预后肿瘤细胞出现血管萎缩、核体积增大、细胞分裂不旺盛等特征,生理盐水对照组和MMB干预组肿瘤体积和质量间差异有统计学意义,表明MMB体内显著抑制结直肠癌组织生长;4.MMB未主要通过凋亡,坏死,铁死亡等方式抑制结直肠癌细胞活力应用Annexin V-FITC/PI双染法分析MMB干预对DLD-1、SW480、HCT116细胞凋亡水平的影响,结果表明MMB未显著引起三种细胞凋亡,进一步通过Western blot证实MMB未显著影响凋亡相关蛋白BCL-2,Caspase3,Caspase8,Bax,PARP-1表达。我们分别应用凋亡抑制剂 Z-VAD-FMK(3μM)、坏死抑制剂 Necrostatin-1(20μM)、铁死亡抑制剂 Ferrostatin-1(2μM)分别与梯度浓度的MMB共干预DLD-1、SW480、HCT116细胞48 h后测定细胞活力。结果表明加入抑制剂未显著逆转MMB对结直肠癌细胞的抑制作用。以上结果表明MMB未主要通过凋亡、坏死、铁死亡等方式抑制结直肠癌细胞活力;5.MMB通过ATM-WEE1通路显著诱导结直肠癌细胞G2/M期阻滞流式细胞术分析PI染色结果表明MMB显著诱导DLD-1、SW480、HCT116细胞G2/M期阻滞。Western blot结果表明MMB显著上调G2/M期检查点CDK1 Tyr15磷酸化水平,上调CDC25C Ser216磷酸化以及WEE1 Ser642磷酸化水平均可导致CDK1 Tyr15磷酸化水平增加并引起G2/M期阻滞。进一步研究确定,MMB显著上调CDC25C Ser216磷酸化以及WEE1 Ser642磷酸化。ATM可通过激活CHK1上调CDC25C Ser216磷酸化水平并最终导致G2/M期阻滞。ATM抑制剂CGK733(10 μM)和WEE1抑制剂MK1775(1 μM)均显著下调CDK1 Tyr15磷酸化水平,并逆转MMB诱导的DLD-1、SW480、HCT116 G2/M期阻滞。以上结果表明,MMB通过ATM-WEE1通路显著诱导结直肠癌细胞G2/M期阻滞;6.MMB诱导结直肠癌细胞系DLD-1自噬Western blot结果表明MMB上调LC3Ⅱ表达,下调p62表达,ULK Ser317磷酸化水平提高,引起细胞自噬。同时AMPK磷酸化水平升高,mTOR磷酸化水平降低。文献调研表明,ATM激活AMPK磷酸化,以上结果表明,MMB通过ATM-AMPK途径诱导结直肠癌细胞自噬。我们得出以下结论:1.一定浓度MMB显著抑制结直肠癌细胞系DLD-1、SW480、HCT116细胞活力,其抑制作用呈现剂量依赖性。2.MMB在体内显著抑制结直肠癌生长。3.MMB通过ATM-WEE1通路引起结直肠癌细胞周期G2/M期阻滞。4.MMB抑制结直肠癌细胞活力与其诱导结直肠癌细胞发生自噬相关。