目的口腔是人体五大菌库之一,超过700种细菌寄居于此。口腔微生物与口腔健康及全身健康密切相关,其中口腔链球菌和具核梭杆菌是人口腔中常见的微生物且两种细菌均含多种亚种,不同亚种对人体健康的影响略有不同。口腔链球菌属于口腔正常组分细菌,是早期定植于口腔的微生物之一,特定条件下可以引起感染性心内膜炎。该菌可分为三个亚种,分别是口腔亚种、dentisani亚种和tigurinus亚种,不同亚种的口腔链球菌在基因组成和功能上有所不同。目前针对口腔链球菌的亚种或菌株间基因组差异的研究还不完善,本课题通过比较口腔源的三株口腔链球菌的基因组,对细菌基因组组分和相关功能基因的差异进行深入探讨,为未来预防和治疗口腔链球菌引起的感染提供理论参考。具核梭杆菌是牙周优势菌,与牙周炎的发生和严重程度的增加密切相关。在牙菌斑形成过程中,具核梭杆菌是重要的桥梁微生物,通过与口腔早期定植菌结合促进致病细菌黏附和定植。此外,该细菌在全身系统性疾病中同样发挥重要作用,目前的研究发现其与直肠癌、不良妊娠结局、糖尿病等疾病都密切相关。该细菌可以细分为四个亚种,分别是具核亚种、文氏亚种、多形亚种和动物亚种,四个亚种在不同性别人群中检测率亦有差异。目前针对该菌的不同亚种在体内对牙周组织的致病性比较罕有报道,本课题使用不同亚种具核梭杆菌感染大鼠牙周组织建立了牙周炎体内模型,系统比较了不同亚种对牙周组织的致病性差异,为具核梭杆菌致病性的研究提供参考。方法采集不同口腔健康状态的志愿者多个部位的口腔微生态样本,在不同氧气浓度、营养条件下进行培养,获得口腔细菌单菌落。通过16S rRNA扩增和全长测序对单菌落进行鉴定,建立口腔微生物菌种资源库,从中筛选出口腔链球菌菌株和具核梭杆菌菌株进行后续研究。提取口腔链球菌三个菌株(SO、SOT、SOD)的全基因组DNA,进行测序组装并获得全序列的基因组完成图,进行基因组分分析和功能预测。预测三个菌株中的基因岛、CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)、前噬菌体等组分。使用KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)数据库、VFDB(Virulence Factors of Pathogenic Bacteria)数据库、GO(Cluster of Orthologous Groups of proteins)数据库、ARDB(Antibiotic Resistance Genes Database)数据库进行基因功能、毒性因子以及抗生素抗性基因的预测。将口腔链球菌代表菌株Uo5全基因组序列作为参考序列,开展口腔链球菌比较基因组分析,分别对三个菌株进行共有-核心基因比对、单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)分析、共线性分析、系统进化树分析。在具核梭杆菌构建牙周炎体内模型的研究中,将大鼠均分为7组,分别为:空白对照组(一过性丝线结扎并注射PBS),单纯结扎组(丝线结扎并注射PBS),FNN组(丝线结扎并龈下注射具核梭杆菌标准菌株ATCC25586),FNA组、FNP组、FN51190组、FN49256组(分别在龈下注射新分离的四株具核梭杆菌),每组各6只。实验组在上颌第二磨牙处用丝线结扎,每两天在上颌第二磨牙近中颊侧龈沟内注磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffered Saline,PBS)或0.5×109CFU单位的细菌,共注射3次。丝线结扎术后正常饮食饲养2周,处死,取上颌骨。离体的上颌骨使用Micro-CT扫描并进行三维重建,测量牙颈部最凹点到牙槽嵴顶(alveolar bone crest,ABC)的距离代表牙槽骨吸收量。实验数据使用GraphPadPrism 6.0软件进行单因素方差分析,统计结果以均数(mean)±标准差(standard deviation,SD)表示,P<0.05具有统计学意义。上颌骨及上颌磨牙进行组织切片,苏木精-伊红染色(hematoxylin and eosin,HE)比较牙龈上皮炎症程度。结果1.口腔微生物菌种资源库:共分离培养到了 1743株口腔细菌。16S rRNA比对结果显示这些细菌属于48个菌属(genus),129个菌种(species)。其中包括口腔链球菌的三个亚种和具核梭杆菌的四个亚种。2.口腔链球菌比较基因组研究:全基因组序列比对、基因功能注释及系统进化树结果显示两株细菌属于口腔链球菌亚种(菌株SOT、SOD),一株属于婴儿链球菌(菌株SO)。SOT和SOD在基因进化上近缘性较高,抗生素抗性基因基本一致。与口腔链球菌标准菌株Uo5相比,SOD在单核苷酸多态性、共有基因方面一致性较高,SOT在基因共线性方面一致性较高。SO与SOT、SOD基因组差异明显,基因组内的抗性基因差别较大。三个菌株内包含的致病相关基因不同,荚膜相关基因分类和位置不同。3.具核梭杆菌体内构建牙周炎模型分析:单纯丝线结扎组和牙周内注射具核梭杆菌组牙槽骨高度与对照组相比明显降低(P<0.05)。FN51190组较单纯结扎组牙槽骨高度明显降低,其余细菌注射组与单纯丝线结扎组,以及细菌组两两间牙槽骨高度降低没有明显差异。HE染色切片可以在细菌注射组牙龈上皮内观察到明显炎症。结论1.口腔中微生物种类丰富,个体间细菌差异表现在菌株层面。进化关系的分析用单一技术鉴定存在不确定性,如口腔链球菌和婴儿链球菌部分菌株16S rRNA相似性高难以区分,基因组其他特异基因能对其加以区分。2.人口腔中培养鉴定的口腔链球菌的基因组中包含了多种不同的致病基因,如与细菌黏附、定植、免疫逃逸相关的基因,说明口腔中的口腔链球菌有致病潜力,且菌株间有差异。3.人口腔中分离的具核梭杆菌对牙周组织都有破坏作用,作用表现在刺激牙周组织炎症反应,且炎症反应进展较慢。