论文部分内容阅读
研究背景:乳腺癌作为世界上常见恶性肿瘤其发病率呈逐年上升[1]。手术是乳腺癌最常见的治疗方法,其次为术后辅助化疗。然而手术创伤大,化疗副作用多,部分癌细胞还具有显著耐药性[2,3]。因此,开发毒性低、副作用少的新型抗肿瘤药物尤为重要。肿瘤的发生与发展不仅体现为细胞增殖失控、分化异常,也与肿瘤细胞凋亡失衡密切相关。伴随分子生物学的不断发展进步,科学家发现凋亡并非是决定细胞死亡的唯一命运。近年,细胞自噬被证实与凋亡共同调控细胞死亡,不同情况下,自噬可能抑制或是促进凋亡。Apoptin是一种具有特异性诱导多种肿瘤细胞凋亡作用的新型抗肿瘤生物蛋白。虽然其诱导某些肿瘤细胞凋亡得以肯定,但对其具体机制仍不明确,并且与凋亡密切的相关的另一种死亡形式——自噬,是否也与apoptin相关至今未有人提出。本实验旨在发现apoptin对肿瘤细胞MCF-7的抗肿瘤作用及其发生的相应分子机制。研究目的:利用本课题组已构建的人5型腺病毒为载体三种重组腺病毒Ad-VT、Ad-VP3和Ad-MOCK,研究表达apoptin蛋白的重组病毒Ad-VT和Ad-VP3对肿瘤细胞MCF-7的杀伤作用参与方式,是否为自噬或凋亡,是否为是二者均有,它们之间是否又存在联系及可能参与的信号通路,为apoptin的进一步研究和开发提供理论依据。研究方法:MTS细胞活性检测,分析三种重组腺病毒Ad-VT、Ad-VP3和Ad-MOCK对肿瘤细胞MCF-7和人乳腺上皮细胞MCF-10A的杀伤抑制作用。利用自噬抑制剂3-MA的Annexin V-FITC/PI.流式实验,qPCR和Western blot检测自噬相关蛋白LC3、P62和Beclin-1的定量定性实验,鉴定自噬的多种染色实验(MDC、IFA、p EGFP-LC3)及透射电镜实验,分析Ad-VT、Ad-VP3和Ad-MOCK对MCF-7细胞的自噬作用。通过细胞周期检测、AnnexinV-FITC/PI检测、Hoechst染色、JC-1染色、透射电镜等实验,分析Ad-VT、Ad-VP3和Ad-MOCK对MCF-7细胞的凋亡作用。通过伤口愈合实验和BioCoat小室侵袭实验,分析Ad-VT、Ad-VP3和Ad-MOCK对MCF-7细胞迁移和侵袭能力的影响。通过蛋白质组学实验分析携带apoptin的重组腺病毒Ad-VT和Ad-VP3作用MCF-7细胞后,产生的差异蛋白的功能和可能参与的信号通路。检测已构建含萤火虫荧光素酶的MCF-7细胞通过荧光素酶活性、稳定性,体外成像筛选出最稳定表达荧光素酶的MCF-7-luc。进行MCF-7-luc细胞和MCF-7细胞的生长特性、侵袭能力和细胞周期等生物学特性的比对检测。通过细胞抑制率MTS实验、细胞膜AnnexinV-FITC/PI流式实验、细胞核Hoechst染色实验验证Ad-VT、Ad-VP3和Ad-MOCK对MCF-7-luc细胞和MCF-7细胞的作用效果。建立小鼠皮下荷瘤模型后,通过活体成像实验、游标卡尺测量肿瘤体积及生存期观察,研究Ad-VT、Ad-VP3和Ad-MOCK对肿瘤的抑制效果和小鼠生存期的影响。研究结果:1.体外MTS实验发现携带apoptin的Ad-VT和Ad-VP3对人乳腺癌MCF-7细胞具有杀伤作用,对人乳腺上皮细胞MCF-10A无显著杀伤作用。Ad-MOCK对MCF-7细胞和MCF-10A无杀伤作用。2.流式细胞术、Western Blot、qPCR、MDC染色、IFA和透射电镜实验提示携带apoptin的Ad-VT和Ad-VP3在细胞作用早期(6h和12h)促进肿瘤细胞MCF-7自噬增强。3.通过细胞周期检测、AnnexinV-FITC/PI检测、Hoechst染色、JC-1染色、透射电镜实验,发现携带apoptin的Ad-VT和Ad-VP3促进人乳腺癌MCF-7细胞发生凋亡。4.通过伤口愈合实验和BioCoat小室侵袭实验,发现携带apoptin的Ad-VT和Ad-VP3能够抑制MCF-7细胞的迁移和侵袭能力。5.蛋白质组学实验对差异蛋白进行GO和KEGG分析提示:携带apoptin的Ad-VT和Ad-VP3作用能够促发人乳腺癌细胞MCF-7的自噬和凋亡。FOXO1和FOX03a蛋白参与apoptin引起细胞死亡的机制,特别是AMPK信号通路。6.选择活性最高、稳定性最好且与发光强度呈正相关的线性关系(R2=0.9903)的Clone 15株进行实验;通过MCF-7-luc细胞和MCF-7细胞生物学特性鉴定,证明了构建过程对细胞的生长特性、侵袭能力和细胞周期未产生显著的影响。体外MTS实验、AnnexinV-FITC/PI流式实验和Hoechst染色实验证实重组腺病毒对MCF-7-luc细胞和MCF-7细胞的作用效果无显著差别,可使用MCF-7-luc细胞进行小鼠荷瘤实验。7.体内实验裸鼠活体成像提示:携带apoptin的Ad-VP3和Ad-VT治疗组与对照组相比肿瘤平均生物发光强度较低,肿瘤体积变小,荷瘤小鼠的生存期延长。研究结论:携带apoptin的重组腺病毒可显著抑制人乳腺癌细胞MCF-7的生长,而对人乳腺正常上皮细胞MCF-10A无抑制作用。携带apoptin的重组腺病毒主要以细胞凋亡方式引起MCF-7细胞的死亡,同时会对细胞自噬产生显著的影响,在作用的早期,自噬对癌细胞起到保护性作用,而在凋亡水平逐渐占据主导时,凋亡作用已经超过自噬所起到的保护作用的阈值,自噬开始逐渐降低,而后至48h左右自噬再一次升高和凋亡共同作用促进MCF-7细胞死亡。FOXO1蛋白和FOX03a蛋白参与了 apoptin引发的MCF-7细胞的自噬和凋亡,特别是与FOXO蛋白相关的AMPK信号通路,因此本研究认为AMPK可能将细胞自噬和细胞凋亡联系起来作为apoptin引起肿瘤细胞死亡的调控通路。