肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)属于消化系统恶性肿瘤,肝癌患者的死亡率在全球排第三位,每年可发生高达700000例的病例。发病原因大多是由病毒性肝炎、酒精或肝毒物质引起。对于肝癌的治疗,临床上一般以手术切除和化疗作为主要手段,但是目前使用的化疗药物不良反应大、选择性差、易引起耐药性,因此,选取中药对肝癌进行治疗的优势日益突出,目前,已有大量关于中药治疗肝癌的研究,并且许多中药活性成分已经被证实具有治疗肝癌的药理活性。葛根芩连汤来源于汉·张仲景《伤寒论》,处方由葛根、甘草、黄芩和黄连四味药组成,是中医药配伍精华理论的名方之一。中药复方成分多,作用靶点多,经吸收入血生物转化后,产生疗效的可能是存在于复方中的药物原型,也可能是复方代谢产物或新物质。基于中药复方的特点,对中药复方药效的研究不应该只局限于研究复方整体的作用,或只研究复方中单一成分及含量较高的成分,应当充分考虑中药复方的药代动力学特点,选取中药复方含药血清与主要代谢入血成分作为对象进行研究,并结合体内外实验及血清药理等方法,从复方含药血清与主要代谢物入手,可以更充分有效地阐明中药复方的作用机理。目前对于葛根芩连汤的大多数研究都只限于整方及主要单体的质量控制及药效作用研究,而主要单体成分不一定是最好的药效活性成分,基于对葛根芩连汤整方及代谢成分药效作用的相关研究较少,本研究将以此对葛根芩连汤进行更深入、更详尽地开发研究,此外,本研究方法也为复方的研究及新化合物作为先导药物提供了新的思路。本研究利用MTT比色法、实时荧光定量PCR法和western blot法研究葛根芩连汤含药血清及其主要代谢物对huh7肝癌细胞株P38MAPK信号通路的影响和相互关系。首先通过MTT法确定含药血清组及各代谢物组给药浓度,再用荧光定量PCR法检测huh7细胞P38MAPK信号通路中各基因mRNA转录水平;Western blot法检测huh7细胞P38MAPK信号通路中各蛋白的表达情况。蛋白质凝胶电泳结果表示,葛根芩连汤含药血清组对P38、JNK的表达有上调作用,对ERK的表达有下调作用;葛根素对ERK的表达有下调作用,对JNK的表达有上调作用;大豆苷对P38、JNK的表达有上调作用;大豆苷苷元对P38的表达有上调作用(P<0.05)。通过研究结果可知,葛根芩连汤与葛根素、大豆苷、大豆苷苷元对P38MAPK信号通路的影响各不相同,但三者药效的协同作用是与葛根芩连汤一致的,因此,选取葛根芩连汤及其主要代谢物进行平行研究,可以更好地揭示葛根芩连汤发挥药效作用的机制,更有利于对葛根芩连汤及其药效物质之间的关系进行深入探索和开发。本研究将血清药理学与蛋白质组学中2-DE技术相互结合,通过分析大鼠对照血清和大鼠给药血清作用后的两组huh7细胞双向电泳图谱,寻找两组中的差异蛋白,从而能够准确、有效地展示与葛根芩连汤作用相关的蛋白。研究结果表明,大鼠对照血清组细胞与大鼠给药血清组细胞,两组差异表达的蛋白质点数为60个,利用质谱成功鉴定出5个差异蛋白,分别为:纤连蛋白(Fibronectin)、Deoxyuridine 5’-triphosphate nucleotidohydrolase、铜-锌超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase[Cu-Zn])、腺苷酸环化酶1(Adenylate cyclase type1)、GDP解离抑制因子(Rho GDP dissociation inhibitor,GDI)。其中,纤连蛋白、Deoxyuridine 5’-triphosphate nucleotidohydrolase、铜-锌超氧化物歧化酶呈下调表达,腺苷酸环化酶1、GDP解离抑制因子呈上调表达,研究发现的5种蛋白,为进一步研究葛根芩连汤的作用机制提供了理论依据。