【摘 要】
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迄今为止,由严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2（SARS-CoV-2）引起的新型冠状病毒肺炎（COVID-19,简称“新冠肺炎”）确诊病例已经超过1.5亿例,并且感染人数还在持续增加,因此迫切需要安全有效的疫苗应对COVID-19大流行,以实现群体免疫。目前,有多种疫苗平台用于SARS-CoV-2疫苗开发,其中基于重组蛋白的非复制型亚单位疫苗是通过特定的表达系统表达获得病原微生物部分具有强免疫原性的
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迄今为止,由严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2（SARS-CoV-2）引起的新型冠状病毒肺炎（COVID-19,简称“新冠肺炎”）确诊病例已经超过1.5亿例,并且感染人数还在持续增加,因此迫切需要安全有效的疫苗应对COVID-19大流行,以实现群体免疫。目前,有多种疫苗平台用于SARS-CoV-2疫苗开发,其中基于重组蛋白的非复制型亚单位疫苗是通过特定的表达系统表达获得病原微生物部分具有强免疫原性的抗原,在人类中已证实其安全性和有效性。考虑到疫苗开发生产的成本、产量以及效率,与其他表达系统相比,大肠杆菌用于外源蛋白表达具有明显的优势。近年来,本实验室已通过大肠杆菌表达系统成功开发了戊型肝炎病毒（HEV）疫苗和人乳头瘤病毒（HPV）疫苗,并在临床上验证具有可靠的安全性和有效性。因此,利用大肠杆菌表达系统,如果能够获得可以在动物体内引起强烈免疫反应和保护效果的SARS-CoV-2免疫原分子,将有望为全球迅速提供廉价、安全且有效的疫苗。本研究旨在评估SARS-CoV-2 S蛋白受体结合域（RBD）与白喉毒素无毒突变体CRM197的催化结构域A融合的免疫原（命名为“CRMA-RBD”）,作为新冠重组亚单位候选疫苗的潜力。通过原核表达系统构建CRMA-RBD和未融合的RBD对照蛋白,经包涵体纯化和色谱柱纯化,并在合适的缓冲条件下有效复性,两种蛋白在溶液中均以单体形式存在,均一性较好。进一步通过Western blot、ELISA、SPR等实验证实了CRMA-RBD与RBD特异性抗体及COVID-19患者恢复期血清有强反应性,与细胞表面受体血管紧张素转换酶2（ACE2）有较强的亲和力,表明大肠杆菌来源的CRMA-RBD蛋白维持RBD结构域的天然构象,并且具有天然SARS-CoV-2抗原决定簇。在BALB/c和C57BL/6小鼠模型中,我们评价了 CRMA-RBD蛋白与不同佐剂的免疫刺激效果,结果显示重组CRMA-RBD联合FH-002C-Ac佐剂免疫BALB/c小鼠后能引起较强的体液免疫应答,产生高滴度的特异性IgG抗体和中和抗体,与联合弗氏佐剂的效果基本相当。联合弗氏佐剂和铝佐剂进行免疫,CRMA-RBD引起的IgG抗体滴度水平和中和效价高于RBD蛋白。此外,CRMA-RBD蛋白能够诱导的病毒特异性CD4+和CD8+T细胞应答,优于RBD蛋白。在C57BL/6小鼠模型中,CRMA-RBD联合FH-002C-Ac佐剂免疫效果较好,产生的特异性IgG抗体滴度最高,并且CRMA-RBD联合铝佐剂和FH-002C-Ac佐剂都能够诱导抗原特异性CD4+和CD8+T细胞免疫应答。总之,大肠杆菌来源的CRMA-RBD疫苗联合不同佐剂,可以在小鼠体内引起强烈的免疫反应。综上,本研究通过大肠杆菌表达系统开发了一种基于重组CRMA-RBD蛋白的新型SARS-CoV-2亚单位候选疫苗。研究结果表明,CRMA-RBD蛋白具有良好的理化性质,在BALB/c小鼠中表现出较好的免疫原性,能够诱导较强的体液免疫应答和细胞免疫应答,并且该蛋白表达纯化工艺稳定,可进行大规模生产。这些特征支持着大肠杆菌来源的CRMA-RBD蛋白进一步发展,为新冠疫苗研发提供了一种新的思路。
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