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活性氧(ROS)是生物体有氧代谢中的副产物,是一类以氧为中心的自由基分子的总称,具有比分子氧更高的氧化活性。许多研究表明自由基对生物大分子的氧化性损伤与癌症、心脑血管疾病和糖尿病等密切相关。抗氧化剂作为活性氧的清除剂,已经成为自由基生物学与医学领域的研究热点。寻找优异的抗氧化剂,是生命科学领域的重要课题之一。植物多酚作为天然抗氧化剂,因具有抗氧化、抗炎抑菌、抗病毒和抗肿瘤等作用而受到广泛关注。乌榄(CanariumpimelaLeenhouts.)是我国南方特有的亚热带常绿果树之一,含有丰富的多酚。但是,目前国内外鲜有关于乌榄多酚化合物组成及其功效的报道。本课题以西山乌榄果实为材料,研究其营养成分组成、发育过程中的多酚含量与自由基清除能力之间的关系、多酚提取和纯化工艺、多酚成分的分离和结构鉴定并评价其抗氧化作用,对乌榄资源的深度开发利用及其药理研究提供理论依据,对乌榄种植业和加工业的发展具有指导作用和应用价值,主要结果如下:
(1)对乌榄新鲜果实不同部位的营养成分组成进行测定,结果表明,乌榄果肉中蛋白质含量为3.16g/100g,脂肪含量为20.2g/100g,总糖为5.09g/100g。乌榄核仁中蛋白质含量为23.9g/100g,脂肪含量为59.7g/100g,总糖为1.40g/100g。果肉和核仁蛋白的氨基酸种类齐全,氨基酸组成接近FAO/WHO组织推荐的理想模式值。果肉和核仁脂肪的主要脂肪酸种类皆为:棕榈酸、油酸和亚油酸,这三种酸的总和占全部脂肪酸的比例分别为90.06%和94.26%,果肉和核仁脂肪的不饱和脂肪酸的比例分别为60.84%和69.93%。乌榄果肉多酚含量为2.68g/100g,黄酮含量为99.07mg/100g。此外,研究结果还显示,乌榄果肉和核仁含有丰富的钙、钾和镁等矿物质元素。
(2)分别测定不同发育时期的乌榄果实的重量、多酚含量及其自由基清除能力,分析各指标之间的相关性。结果表明,乌榄果实的生长曲线呈双“S”形;多酚含量与自由基清除能力的相关性分析表明,DPPH·清除能力与多酚含量的相关系数r=0.982,P<0.01,呈极显著相关;O2·-清除能力与多酚的相关系数r=0.866,P<0.05,呈显著相关,提示多酚是乌榄的主要抗氧化活性物质。
(3)探讨了不同影响因素对乌榄多酚提取效果的影响,获得最佳的提取条件:提取3次、提取温度为70℃、料液比为1:20和乙醇浓度为40%。在乌榄多酚的纯化实验中,比较了6种大孔树脂(AB-8、S-8、NKA、NKA-Ⅱ、X-5与D-101)对乌榄多酚的吸附率和解吸率,选择D-101作为吸附树脂。在上样液浓度为2.0mg/ml、上样流速为3.0BV/h、洗脱剂为90%的乙醇、洗脱流速1.5BV/h的纯化条件下,经大孔树脂纯化后,多酚粗提物的纯度由28.6%提高到63.2%,纯化倍数约为2.2倍,多酚回收率为64.3%。
(4)运用柱层析、重结晶、薄层层析等方法对乌榄乙酸乙酯部进行分离,用质谱、紫外、核磁共振等技术从中鉴定出8个化合物单体,分别为:穗花杉双黄酮、山柰酚-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、莽草酸、槲皮素、山奈酚、3,3-二甲氧基鞣花酸、3,3,4-三甲氧基鞣花酸与豆甾醇,上述8个化合物均为首次从乌榄中分离得到,其中莽草酸、山奈酚、3,3,4-三甲氧基鞣花酸与豆甾醇为首次从橄榄属植物中分离得到。
(5)用不同的化学体系评价乌榄不同萃取部和化合物的抗氧化活性,结果显示,不同提取物和化合物对DPPH·的EC50从小到大依次为:没食子酸(5.81μg/ml)<槲皮素(7.47μg/ml)<乙酸乙酯部(8.52μg/ml)<正丁醇部(9.17μg/ml)<粗提物(13.89μg/ml)<山奈酚(14.55μg/ml)<水部(18.25μg/ml)<石油醚部(31.84μg/ml),对·OH的EC50从小到大依次为:槲皮素(96.07μg/ml)<乙酸乙酯部(114.21μg/ml)<正丁T醇部(144.05μg/ml)<VC(151.58μg/ml)<山奈酚(188.02μg/ml)<粗提物(209.97μg/ml)<水部(332.51μg/ml)<石油醚部(357.48μg/ml),对O2·-的EC50从小到大依次为:乙酸乙酯部(28.38μg/ml)<正丁醇部(33.72μg/ml)<槲皮素(40.01μg/ml)<芦丁(45.98μg/ml)<粗提物(48.98μg/ml)<山奈酚(54.89μg/ml)<水部(72.06μg/ml)<石油醚部(98.14μg/ml);当浓度为100μg/ml时,各提取物的总抗氧化能力从大到小依次为:槲皮素(242.36U/mg)>乙酸乙酯部(212.32U/mg)>VC(193.32U/mg)>山奈酚(142.11U/mg)>正丁醇部(102.55U/mg)>粗提物(54.24U/mg)>水部(44.24U/mg)>石油醚部(32.72U/mg)。上述结果表明,乌榄的主要抗氧化活性部位是乙酸乙酯部,槲皮素和山奈酚是乌榄的主要抗氧化物质之一。