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目的:心血管疾病（CVD）是目前全球最主要的死亡原因之一,发病率逐年上升,且呈现年轻化趋势。现阶段的研究发现,氧化应激与多种心脏的异常状态和疾病的发生发展有关。氧化应激是人体氧化能力与抗氧化能力失调导致的一种异常状态,会引起多种心血管系统的异常反应和疾病。氧化应激主要由体内的两类活性物质引起:活性氧（ROS）和活性氮（RNS）。生理条件下,这些活性物质参与维持正常的生理活动。但是当外界的刺激打破平衡时,继发的氧化应激损伤会对细胞造成灾难性的影响。细胞凋亡是一种细胞程序性死亡,对于维持机体的正常生理功能是必要的。然而,不受控制的细胞凋亡会对机体造成严重的损伤。免疫细胞的凋亡被抑制会导致机体出现自身免疫性疾病,神经细胞的过度凋亡是各类神经退行性疾病的基本特征,急性心肌梗死（AMI）以及后续的再灌注都会引起心肌细胞的凋亡。因此,维持细胞凋亡的平衡有助于疾病的防治。细胞凋亡可被分为caspase依赖途径与非caspase依赖途径。在Caspase依赖途径中,Caspase3活化后生成cleaved Caspase3,后者可以剪切聚（ADP-核糖）聚合酶1（PARP1）并促进cleaved PARP1的产生。在被称为“Parthanatos”的一种不依赖caspase的细胞凋亡途径中,严重的刺激可以使PARP1被过度激活,促进多聚（ADP-核糖）（PAR）的合成,PAR可以促进凋亡诱导因子（AIF）进入细胞核,进而引起大规模的DNA断裂和染色质凝聚。而cleaved PARP1也在最近被发现可以增强PAR对AIF的作用。Septin4是一种凋亡相关蛋白,可以抑制肝纤维化和肿瘤等疾病的发生发展,与PARP1存在交互作用。而且,Septin4、cleaved Caspase3和PARP1存在时相与空间上的统一,这提示三者可能相互影响,共同参与并调控了细胞凋亡。本研究探讨了Septin4在氧化应激诱导的心肌细胞损伤中的作用以及相关机制。方法:1、探讨H2O2刺激是否可以诱导H9C2心肌细胞的缺血再灌注损伤以及对Septin4表达的影响。我们先将H9C2心肌细胞分为4组,分别用0μmol/L、50μmol/L、100μmol/L和150μmol/L的H2O2刺激细胞90分钟,然后检测细胞的活力、凋亡率以及Septin4、cleaved Caspase3和cleaved PARP1的表达量。我们再将H9C2心肌细胞分为4组,用150μmol/L的H2O2分别刺激细胞0分钟、30分钟、60分钟、90分钟,然后检测Septin4、cleaved Caspase3和cleaved PARP1的表达量。2、探讨过表达Septin4对H2O2诱导的H9C2心肌细胞损伤的影响。我们将H9C2心肌细胞分为4组:Flag Vector组、Flag Vector+H2O2（150μmol/L,90 min）组、Flag Septin4组、Flag Septin4+H2O2（150μmol/L,90 min）组,然后检测细胞的凋亡率以及Septin4、cleaved PARP1和cleaved Caspase3的表达量和PARylation的水平。我们再将H9C2心肌细胞分为8组:Flag Vector组、Flag Septin4组、Flag Vector+H2O2（150μmol/L,30 min）组、Flag Septin4+H2O2（150μmol/L,30 min）组、Flag Vector+H2O2（150μmol/L,60 min）组、Flag Septin4+H2O2（150μmol/L,60 min）组、Flag Vector+H2O2（150μmol/L,90 min）组、Flag Septin4+H2O2（150μmol/L,90 min）组,然后检测细胞的活力。3、探讨过表达Septin4对H2O2诱导的大鼠乳鼠原代心肌细胞损伤的影响。我们首先检测Flag Septin4是否成功被转染进细胞。接下来我们将细胞分为4组:Flag Vector组、Flag Vector+H2O2（150μmol/L,90 min）组、Flag Septin4组、Flag Septin4+H2O2（150μmol/L,90 min）组,然后检测细胞凋亡水平以及Septin4、cleaved PARP1和cleaved Caspase3的表达量。4、探讨敲减Septin4对H2O2诱导的H9C2心肌细胞损伤的影响。我们将H9C2心肌细胞分为4组:sh con组、sh con+H2O2（150μmol/L,90 min）组、sh Septin4组、sh Septin4+H2O2（150μmol/L,90 min）组,然后检测细胞的凋亡率以及Septin4、cleaved PARP1和cleaved Caspase3的表达量和PARylation的水平。我们再将H9C2心肌细胞分为8组:sh con组、sh Septin4组、sh con+H2O2（150μmol/L,30 min）组、sh Septin4+H2O2（150μmol/L,30 min）组、sh con+H2O2（150μmol/L,60 min）组、sh Septin4+H2O2（150μmol/L,60 min）组、sh con+H2O2（150μmol/L,90 min）组、sh Septin4+H2O2（150μmol/L,90 min）组,然后检测细胞的活力。5、探讨在正常条件下及H2O2刺激条件下Septin4与cleaved Caspase3和PARP1的结合情况。我们将蛋白按照所加抗体分为四个大组,每个大组包括两个小组:Septin4抗体组和IgG组;cleaved Caspase3抗体组和IgG组;Septin4抗体组和IgG组;PARP1抗体组和IgG组。然后我们分别检测cleaved Caspase3、Septin4、PARP1、Septin4的表达量。我们再将蛋白按照所加抗体及刺激条件分为四个大组,每个大组包括三个小组:Septin4抗体组、Septin4抗体+H2O2（150μmol/L,90 min）组和IgG组;cleaved Caspase3抗体组、cleaved Caspase3抗体+H2O2（150μmol/L,90 min）组和IgG组;Septin4抗体组、Septin4抗体+H2O2（150μmol/L,90 min）组和IgG组;PARP1抗体组、PARP1抗体+H2O2（150μmol/L,90 min）组和IgG组。然后我们分别检测cleaved Caspase3、Septin4、PARP1、Septin4的表达量。6、探讨Septin4在cleaved Caspase3剪切PARP1中的作用。我们将蛋白按照所加抗体及Septin4是否被过表达分为四个大组,每个大组包括三个小组:cleaved Caspase3抗体组、cleaved Caspase3抗体+Flag Septin4组和IgG组;PARP1抗体组、PARP1抗体+Flag Septin4组和IgG组;cleaved Caspase3抗体组、cleaved Caspase3抗体+sh Septin4组和IgG组;PARP1抗体组、PARP1抗体+sh Septin4组和IgG组。然后我们分别检测PARP1、cleaved Caspase3、PARP1、cleaved Caspase3的表达量。我们再将H9C2心肌细胞分为四组,分别转染0μg、2μg、4μg、6μg的Flag Septin4,然后检测cleaved PARP1、Caspase3和cleaved Caspase3的表达量。接着,我们将Septin4被稳定敲减的H9C2心肌细胞根据敲减序列分为四组:sh con组、sh Septin4target sequence 1组、sh Septin4 target sequence 2组、sh Septin4 target sequence 3组,然后检测cleaved PARP1、Caspase3和cleaved Caspase3的表达量。最后,我们将H9C2心肌细胞分为四组,分别转染si con、si Septin4 target sequence 1、si Septin4target sequence 2和si Septin4 target sequence 3,然后检测cleaved PARP1、Caspase3和cleaved Caspase3的表达量。7、探讨Septin4对H9C2心肌细胞内ROS的累积情况的影响。我们将H9C2心肌细胞分为4组:Flag Vector组、Flag Vector+H2O2（150μmol/L,90 min）组、Flag Septin4组、Flag Septin4+H2O2（150μmol/L,90 min）组,然后检测ROS的累积情况以及3-硝基酪氨酸（3-Nitrotyrosine）、8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶（OGG1）和超氧化物歧化酶1（SOD1）的表达量。我们再将H9C2心肌细胞分为4组:sh con组、sh con+H2O2（150μmol/L,90 min）组、sh Septin4组、sh Septin4+H2O2（150μmol/L,90 min）组,然后检测ROS的累积情况以及3-Nitrotyrosine、OGG1和SOD1的表达量。结果:1、随着H2O2刺激强度的增加,H9C2心肌细胞的活性逐渐降低、凋亡率逐渐升高,Septin4、cleaved Caspase3和cleaved PARP1的表达量逐渐增加。2、与非过表达组细胞相比,在被同样程度的H2O2刺激后,过表达Septin4的H9C2心肌细胞的活性较低、凋亡率较高、cleaved PARP1和cleaved Caspase3的表达量较高、PARylation的程度较高。3、与非过表达组细胞相比,在被同样程度的H2O2刺激后,过表达Septin4的大鼠乳鼠原代心肌细胞的凋亡较严重,cleaved PARP1和cleaved Caspase3的表达量较高。4、与对照组细胞相比,在被同样程度的H2O2刺激后,Septin4被稳定敲减的H9C2心肌细胞的活性较高、凋亡率较低、cleaved PARP1和cleaved Caspase3的表达量较低、PARylation的程度较低。5、Septin4可以与cleaved Caspase3和PARP1结合。在H2O2刺激的条件下,这种结合被增强。6、过表达Septin4可以促进cleaved Caspase3与PARP1的结合。敲减Septin4可以抑制cleaved Caspase3与PARP1的结合。随着细胞内Septin4含量的升高,cleaved PARP1的表达量升高,而Caspase3和cleaved Caspase3的表达量未见明显变化。随着细胞内Septin4含量的降低,cleaved PARP1的表达量降低,而Caspase3和cleaved Caspase3的表达量未见明显变化。7、与非过表达组细胞相比,在被同样程度的H2O2刺激后,过表达Septin4的H9C2心肌细胞的ROS较多,3-Nitrotyrosine、OGG1的表达量较高,SOD1的表达量较低。而Septin4被稳定敲减的H9C2心肌细胞的ROS较少,3-Nitrotyrosine、OGG1的表达量较低,SOD1的表达量较高。结论:1.Septin4参与并促进了H2O2诱导的心肌细胞凋亡。2.Septin4通过形成cleaved Caspase3-Septin4-PARP1调控轴,促进cleaved Caspase3对PARP1的剪切能力,进而促进心肌细胞凋亡。