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目的:结直肠癌是一种世界范围内高发性的疾病,是全球三大常见癌症之一,死亡率在所有肿瘤中位居第二。Anoctamin 1（Ano1）钙激活氯通道在多种肿瘤中高表达,且与患者的不良预后密切相关,有望成为一种新型的肿瘤预后标志物。已有研究表明Ano1在结直肠癌中高表达,并且能够促进结直肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭等生物学行为。有研究发现Ano1的高表达与结直肠癌淋巴结转移相关,而肿瘤转移是导致结直肠癌患者死亡的主要原因。因此,研究Ano1促进结直肠癌转移的分子机制能够为治疗结直肠癌转移提供一个崭新的思路。本研究旨在探讨Ano1促进结直肠癌侵袭和转移的机制,为研发用于治疗结直肠癌转移的靶向Ano1药物提供理论依据。方法:1.采用TCGA和免疫组化方法检测Ano1在结直肠癌患者中的表达差异,以及Ano1高低表达对淋巴结转移情况和结直肠癌患者生存期的影响。利用慢病毒感染技术分别制备Ano1稳定高表达和低表达的细胞株。分别采用细胞划痕实验、Transwell迁移和侵袭实验验证不同Ano1表达水平的结直肠癌细胞的迁移和侵袭能力。通过尾静脉注射结直肠癌细胞建立裸鼠的肺转移瘤模型,采用体外成像技术检测不同Ano1表达水平的结直肠癌细胞的肺转移瘤情况。2.基于转录组学,利用生物信息学对感染Scrambled-sh RNA和Ano1-sh RNA慢病毒的结直肠癌细胞进行差异和通路富集分析确定关键基因。利用q RT-PCR及Western blot方法检测ANXA1在结直肠癌细胞株的表达情况。采用q RT-PCR和Western blot方法检测分别感染空载体和含Ano1基因慢病毒或Scrambled-sh RNA和Ano1-sh RNA慢病毒后结直肠癌细胞中ANXA1的m RNA和蛋白表达情况。转染STAT3质粒及其对照空质粒后,Western blot方法检测ANXA1的蛋白表达情况。采用免疫共沉淀技术检测结直肠癌细胞中Ano1与Src蛋白的结合情况。利用定点突变技术构建P887L/P890L-Ano1突变体,并转染到HEK293细胞中,利用免疫共沉淀技术检测P887L/P890L-Ano1突变体与Src的结合情况。采用Western blot方法检测转染P887L/P890L-Ano1突变体以及给予Src抑制剂Src inhibitor I和STAT3抑制剂JSI-124后下游通路蛋白和ANXA1的表达情况。3.采用免疫共沉淀技术检测结直肠癌细胞中内源性ANXA1和Ano1的结合情况。应用lipofectamin 2000将Scrambled-sh RNA和ANXA1-sh RNA质粒分别转染到结直肠癌细胞中,利用全细胞膜片钳记录模式分别记录Ca2+浓度在0.18μM、0.36μM、1μM、25μM时结直肠癌细胞的Ano1钙激活氯电流。4.利用定点突变技术构建Ca2+结合位点被破坏而表现出低通道活性E654A-Ano1突变体。采用划痕实验、Transwell迁移和侵袭实验检测给予Ano1抑制剂Ani9以及转染E654A-Ano1突变体后结直肠癌细胞的迁移和侵袭能力。应用lipofectamin 2000转染技术,将ANXA1-sh RNA和ANXA1质粒及其对照质粒分别转染到稳定高表达和低表达Ano1的结直肠癌细胞中,利用划痕实验、Transwell迁移和侵袭实验检测转染后结直肠癌细胞迁移和侵袭能力的改变。结果:1.结直肠癌患者中Ano1的表达水平明显高于正常组织。Ano1高表达的患者较Ano1低表达的患者相比出现更多的淋巴结转移,生存时间更短。在RKO细胞中,Ano1的蛋白水平相对较低;在SW620细胞中,Ano1的蛋白水平相对较高。在RKO细胞中,过表达Ano1能够促进结直肠癌细胞的迁移和侵袭能力;在SW620细胞中,Ano1敲低能够抑制结直肠癌细胞的迁移和侵袭能力。尾静脉注射感染Ano1-sh RNA慢病毒的SW620细胞的裸鼠相对于感染Scrambled-sh RNA慢病毒的对照组,肺组织荧光强度明显减弱。2.转录组分析鉴定ANXA1是Ano1调控的细胞迁移相关基因之一;敲低ANXA1抑制结直肠癌细胞的迁移和侵袭。ANXA1的m RNA和蛋白表达在RKO细胞中相对较低,Ano1过表达促进了ANXA1的m RNA和蛋白表达以及p-STAT3/STAT3的表达;ANXA1的m RNA和蛋白在SW620细胞中表达相对较高,Ano1敲低抑制了ANXA1的m RNA和蛋白表达以及p-STAT3/STAT3的表达;STAT3抑制剂JSI-124抑制了Ano1过表达促进ANXA1蛋白表达的能力;过表达STAT3后能够促进RKO细胞中ANXA1的蛋白表达水平。在SW620细胞中,内源性Ano1和Src存在直接的相互作用;P887L/P890L-Ano1突变体抑制WT-Ano1和Src的结合能力。在RKO细胞中,P887L/P890L-Ano1突变体抑制WT-Ano1激活STAT3促进ANXA1表达的作用。Src抑制剂Src inhibitor I抑制了Ano1促进p-STAT3/STAT3、ANXA1蛋白表达的能力。3.在SW620细胞中,内源性的Ano1和ANXA1能够直接结合。相较于转染Scrambled-sh RNA质粒,转染ANXA1-sh RNA质粒后,在全细胞模式下SW620细胞中Ano1钙激活氯电流在不同钙浓度下（0.18μM、0.36μM、1μM、25μM）氯电流强度明显减弱,激活Ano1氯通道的钙离子敏感度呈现电压依赖性降低的特点。4.Ano1氯通道特异性抑制剂Ani9抑制了SW620细胞的迁移和侵袭能力;转染低通道活性的E654A-Ano1突变体质粒能够抑制了RKO细胞中Ano1促进结直肠癌细胞的迁移和侵袭能力。在感染空载体或含Ano1基因慢病毒的RKO细胞中,转染ANXA1-sh RNA质粒显著抑制了Ano1促进细胞迁移和侵袭能力;在感染Scrambled-sh RNA或Ano1-sh RNA慢病毒的SW620细胞中,转染ANXA1质粒促进了SW620细胞的迁移和侵袭,而Ano1敲低显著降低了ANXA1诱导的SW620细胞的迁移和侵袭能力。结论:1.Ano1钙激活氯通道能够促进结直肠癌细胞的侵袭和转移,并且缩短结直肠癌患者的生存时间;2.Ano1钙激活氯通道能够与Src直接结合进而激活Src/STAT3信号通路,从而促进ANXA1的表达;3.ANXA1通过直接结合Ano1以电压依赖性激活Ano1钙激活氯通道;4.Ano1与ANXA1相互依赖促进结直肠癌细胞的迁移和侵袭。