背景:癌症,威胁全球人类健康的主要元凶之一,最新统计显示过去的2018年全球约有1810万新增病例和960万死亡病例。目前,癌症的治疗手段仍然以外科手术治疗为主,辅助放疗、化疗等。然而传统的治疗手段都存在诸多弊端,例如外科手术治疗对肿瘤组织的边界划分存在争议且对远处转移的病灶难以干预;放疗在杀死肿瘤组织的同时,对健康组织亦产生了不可恢复的损害;化疗药物大部分则缺乏特异的靶向性,给患者带来极大的毒副作用,并且肿瘤由于其高突变性而快速产生耐药;此外,免疫治疗尽管作为当前的明星治疗方法,受到广大科研人员的热捧,然而主流的PD-1以及CTLA4抑制剂的临床应答率仍然不高,这其中一方面是由于肿瘤微环境中浸润的T细胞数量不足,另一方面肿瘤细胞未能暴露免疫源性的抗原而无法激活免疫反应。纳米药物与治疗,是一种通过纳米材料独特的结构或性能来达到治疗疾病的方式。伴随着纳米技术与材料的快速发展,越来越多的纳米材料（石墨烯、黑鳞、量子点、聚集诱导发光材料等）应用到了肿瘤的诊断与治疗领域,为肿瘤的治疗提供了全新的思路和希望。伴随着纳米技术的不断发展,仿生纳米材料在生物医学领域得到了广泛的关注。相比一般的纳米材料,仿生纳米材料具有更好的生物相容性和生物学功能的多样性。目前采用包膜技术制作仿生纳米材料是肿瘤诊疗领域应用最为广泛的制备技术之一。髓源性抑制细胞（Myeloid-derived suppressor cell,MDSC）是一群表型异质的细胞,来源于骨髓祖细胞和未成熟髓系细胞,包括不成熟的DC,不成熟巨噬细胞和不成熟的颗粒细胞。目前研究表明MDSC可以分为单核MDSC及多形核MDSC。在人体内,单核MDSC的主要表面标记分子为CD14+HLA-DR-/low;多形核MDSC的主要表面标记分子为CD11b+CD14-CD15+或CD11b+CD14-CD66b+。在小鼠体内MDSC的表面标记分子为CD11b+Gr-1+。而根据表面Ly6G与Ly6C表达的多少分为单核和多形核两种类型。MDSC作为肿瘤免疫微环境的重要成员之一。肿瘤微环境产生的多种细胞因子可以招募MDSC向肿瘤微环境移动。四氧化三铁（Fe3O4）为具有磁性的黑色晶体,又称为磁性氧化铁。目前,通常采用水热法合成磁性Fe3O4纳米颗粒（MNP）。由于Fe3O4纳米颗粒自身优异的光学及理化特性,目前已被广泛应用于肿瘤的诊断与治疗。本研究结合细胞膜涂层纳米技术,将从荷瘤小鼠体内分选的MDSC的细胞膜涂层在Fe3O4纳米颗粒上,合成MNP@MDSC,用于肿瘤的诊断与治疗。第一部分:髓源性抑制细胞膜涂层的四氧化三铁仿生纳米颗粒的制备及体内外表征检测目的:Fe3O4纳米颗粒作为一种多功能纳米材料,具有核磁共振成像、光热、Fenton反应诱导的肿瘤杀伤以及改善微环境的能力。MDSC作为一群来源于骨髓祖细胞和未成熟髓系的细胞,能够响应肿瘤微环境的招募,主动靶向肿瘤微环境。本研究的目的在于构建一种全新的具有主动靶向肿瘤微环境的多功能仿生纳米材料。方法:通过改良的水热法合成磁性Fe3O4纳米颗粒。应用免疫磁珠从荷瘤小鼠体内分离并纯化MDSC,离心法提取其细胞膜。使用迷你推器合成MDSC膜涂层的磁性纳米颗粒（MNP@MDSC）。然后,体外分析MNP@MDSC的表征、稳定性、蛋白组分、抗吞噬能力;体内检测MNP@MDSC的循环时间、生物毒性及器官分布。红细胞膜涂层的Fe3O4纳米颗粒（MNP@RBC）作为阳性对照。结果:利用上述方法成功制备了MNP@MDSC。利用透射电子显微镜对四氧化三铁纳米颗粒（MNP）及MNP@MDSC的形貌大小表征,显示MDSC的细胞膜成功涂层在MNP上。Zeta电势检测显示MNP表面涂层MDSC膜后可见其表面电荷的变化,进一步证实MDSC的细胞膜成功涂层在MNP表面。动态光散射仪检测显示MNP@MDSC在PBS及FBS放置一周期间直径大小基本稳定。SDS-PAGE分析MNP@MDSC表面蛋白质的组分显示MNP@MDSC继承了MDSC的表面蛋白。巨噬细胞吞噬实验显示相比MNP,MNP@MDSC可以有效抵抗巨噬细胞的吞噬。ICR小鼠实验显示MNP@MDSC的循环时间相比MNP和MNP@RBC有了明显提升。血常规、血生化及组织学检测结果提示MNP@MDSC没有明显的生物毒性。结论:成功构建了仿生的MNP@MDSC。其体外具有良好的稳定性、抗吞噬能力;体内具有优异的免疫逃逸能力和循环时间,同时具有良好的生物兼容性,未显示明显的全身毒副作用。可满足后续的肿瘤诊断及治疗的研究。第二部分:髓源性抑制细胞膜涂层的四氧化三铁仿生纳米颗粒在肿瘤诊断中的应用及其光热效应的研究目的:以第一部分合成的MNP@MDSC为基础。考虑到MNP@MDSC为MDSC和MNP的整合体,我们需要检测验证MNP@MDSC是否继承了（1）MDSC对肿瘤微环境的靶向性;（2）MNP的核磁共振成像能力;（3）MNP的光热能力。方法:荷瘤小鼠体内注射MNP@MDSC、MNP@RBC以及MNP,通过普鲁士蓝染色及ICP-AES的方法检测MNP@MDSC是否具有主动靶向肿瘤微环境的能力;通过小动物核磁共振成像仪,体外检测MNP@MDSC是否与MNP的T2弛豫率相似,通过给荷瘤小鼠体内注射MNP@MDSC、MNP@RBC以及MNP,小动物核磁共振成像仪观测三种材料的成像效果及差异;通过近红外激光照射,红外相机检测三种纳米颗粒在体外的光热效果,通过恶性黑色素瘤小鼠移植瘤模型,检测三种纳米颗粒在小鼠体内的光热效果及差异。结果:荷瘤小鼠材料肿瘤靶向实验显示三种纳米颗粒的靶向肿瘤微环境的能力大小依次为:MNP@MDSC>MNP@RBC>MNP;体外核磁共振实验显示MNP@MDSC与MNP的T2弛豫率基本相似（R2=86.73）,表明MNP@MDSC的细胞膜涂层不影响其核磁共振成像能力。体内结果显示注射了MNP@MDSC组的荷瘤小鼠的肿瘤部位相比注射前明显变暗,且变暗的程度明显大于MNP@RBC及MNP成像组;光热效果体外实验显示在接收808激光照射后,三种纳米颗粒的温度上升曲线基本一致。体内实验表明四组小鼠在激光照射5分钟后,肿瘤部位的温度都有了不成程度的提升,并且MNP@MDSC注射组从照射前的34.4℃升高至照射后的54.7℃,其温度提升程度高于其余三组。结论:MNP@MDSC继承了MDSC主动靶向肿瘤微环境的能力以及MNP的核磁共振成像和光热能力。并且MNP@MDSC细胞膜的涂层未对其磁共振成像和光热的能力产生干预。相对于MNP的EPR效应以及MNP@RBC的被动靶向能力,MNP@MDSC显示了优异的主动靶向肿瘤微环境的能力,这赋予了该体系更低的毒副作用,为肿瘤的诊断与治疗打下夯实的基础。第三部分:髓源性抑制细胞膜涂层的四氧化三铁仿生纳米颗粒在肿瘤治疗中的作用目的:光热疗法可使肿瘤细胞发生半胱氨酸蛋白酶依赖性的凋亡现象,并且释放自身抗原和损伤相关模式分子,产生免疫源性的细胞死亡（ICD）;MNP纳米颗粒在肿瘤微环境中可以诱导巨噬细胞向M1型分化。基于以上两点,我们推测,MNP@MDSC通过光热作用引起肿瘤细胞免疫源性的细胞死亡,暴露相关抗原（HMGB1和Calreticulin）;同时MNP@MDSC在小鼠肿瘤微环境中诱导巨噬细胞M1型分化。分化的M1型细胞进一步充当抗原提呈细胞的作用,进一步增强小鼠抗肿瘤免疫反应,从而抑制肿瘤的生长,降低肿瘤的代谢活动。方法:体外通过共培养RAW264.7和B16/F10细胞,PCR检测MNP@MDSC、MNP干涉与否的条件下,巨噬细胞M1型相关基因（i NOS和CD86）和M2型相关基因（Arginase 1和CD206）的表达情况;建立B16/F10小鼠移植瘤模型,检测小鼠给予PBS或者MNP@MDSC、MNP@RBC、MNP后,检测808nm近红外激光光热治疗与否的条件下肿瘤的生长情况。流式细胞术检测CD11b+F4/80+CD86+M1型巨噬细胞、CD11b+F4/80+CD206+M2型巨噬细胞、CD4+辅助性T细胞、CD8+效应T细胞细胞的数量。免疫荧光（IF）检测肿瘤组织中ICD相关蛋白（HMGB1和Calreticulin）、巨噬细胞相关指标（CD86和CD206）、效应T细胞（CD8）、肿瘤增殖和凋亡相关指标（Ki67和TUNEL）的表达情况。小动物PET检测肿瘤代谢的变化。结果:体外RAW264.7和B16/F10细胞共培养体系中,MNP@MDSC和MNP的加入,促进了M1型巨噬细胞相关基因（i NOS和CD86）的表达,与之相反,M2型巨噬细胞相关基因（Arginase 1和CD206）的表达受到抑制;体内抑瘤实验结果显示MNP@MDSC光热治疗组的抑瘤效果优于其余各组（实验干预手段也没有对小鼠的体重产生显著地影响）。流式细胞术检测发现小鼠肿瘤微环境中MNP@MDSC联合光热治疗后,小鼠体内CD11b+F4/80+CD86+M1型巨噬细胞的数量增多,CD11b+F4/80+CD206+M2型巨噬细胞的数量减少。同时小鼠体内CD4+辅助性T细胞、CD8+效应T细胞细胞的数量增多;IF结果提示ICD相关蛋白（HMGB1和Calreticulin）在对照组、MNP组、单独光热治疗组、MNP+光热治疗组、MNP@RBC+光热治疗组、MNP@MDSC+光热治疗组逐渐升高。同时凋亡相关蛋白TUNEL在以上各组的表达亦依次增强。相反,肿瘤细胞增殖相关蛋白Ki67在以上各组的表达逐渐减低;小动物PET成像结果显示在三个矢状面上小鼠肿瘤组织的的代谢活动在对照组、MNP组、单独光热治疗组、MNP+光热治疗组、MNP@RBC+光热治疗组、MNP@MDSC+光热治疗组逐渐降低。SUV（Max）与SUV（Mean）统计值在以上各组亦逐渐降低。结论:MNP@MDSC具有诱导巨噬细胞分化的能力,在荷瘤小鼠体内MNP@MDSC联合光热治疗显著地提高了M1型巨噬细胞的比例,同时M2型巨噬细胞数量降低,而且光热引起了肿瘤细胞免疫源性的细胞死亡（ICD）,促进了相关蛋白的表达。M1型的巨噬细胞和ICD相互作用进一步增强了小鼠的抗肿瘤免疫反应,同时抑制了肿瘤细胞的增殖、促进了肿瘤细胞的凋亡;此外,MNP@MDSC联合光热治疗有效地降低了肿瘤细胞的代谢活动。综上,MNP@MDSC联合光热疗法可以显著抑制肿瘤的生长。MNP@MDSC作为诊疗一体化的体系,具有巨大的临床转化潜力。