胰岛移植自2000年来已成为治疗不稳定性胰岛素依赖型糖尿病的重要手段,同时这也给移植领域带来了新的研究方向。不同于其它终末期疾病所进行的器官移植,胰岛移植的目的更注重改善患者的生存质量,所以更理想的方法是诱导移植免疫耐受状态,即在不使用免疫抑制剂的情况下,维持同种异体移植物功能良好,同时保持机体对其它外来抗原正常的宿主反应。因此,如何诱导同种异体胰岛移植物的免疫耐受成为临床胰岛移植研究发展的方向。骨髓间充质干细胞(Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells,BM-MSCs)有强大的免疫调节作用,可通过分泌多种可溶性分子或通过其与免疫细胞的相互接触等途径抑制抗原特异性或非特异性的淋巴细胞增殖,抑制抗原提呈细胞的分化、成熟,诱导抗原特异性调节性T细胞(T regulatory cell,Treg)的形成,调节机体免疫应答向抗炎症方向偏移,在器官移植、替代治疗等领域具有巨大的临床应用价值。有研究表明:间充质干细胞联合胰岛移植可提高胰岛移植物存活时间,调节胰岛移植物免疫耐受,其作用机制与细胞接触或其分泌的细胞因子有关,但因BM-MSCs功能复杂,目前暂无统一定论。亦有研究表明:滤泡辅助性T细胞(T follicular helper cell,Tfh)作为独立分化来源的新CD4+T细胞亚群,已在多项研究中证实其在自身免疫性疾病、移植免疫与肿瘤免疫等多方面起到重要的调节作用,但是否参与I型糖尿病发生发展尚未可知?因此,我们考虑Tfh细胞是否参与I型糖尿病的发生发展?BM-MSCs是否通过调节Tfh细胞的分化水平从而调节免疫内环境稳态,起到对胰岛移植物的保护作用?本实验就以上问题进行了初步研究。首先在Gotoh胰岛分离技术的基础上进行了改进,使得胰岛分离过程更为简单和有效;同时采用全骨髓培养法分离BM-MSCs细胞并通过流式细胞仪进行鉴定,为BM-MSCs联合胰岛移植提供实验基础。在此基础上,建立非肥胖糖尿病鼠(Non-obese Diabetic mice,NOD)胰岛移植动物模型,研究了不同BM-MSCs联合胰岛移植方案的效果,且初步研究BM-MSCs对Tfh细胞的调控作用,旨在说明MSC是否通过调节Tfh细胞而起到移植胰岛保护作用。第一部分小鼠胰岛的分离与纯化目的:探讨C57BL/6小鼠胰岛分离、纯化的较优方案,并评价分离所得胰岛的生物学特性。方法:小鼠麻醉开腹后,于胰管十二指肠开口处逆行插入24G套管针,先慢后快地注入3m L胰腺消化液,分离胰腺组织,经消化、洗涤、过筛后使用Histopaque-1077溶液与Hanks溶液进行梯度离心,取两溶液中间界面胰岛组织于培养皿中,显微镜下筛选。筛选后的胰岛经双硫腙(DTZ)染色鉴定胰岛细胞,AO/PI染色法鉴定胰岛细胞活性,葡萄糖刺激试验检测胰岛细胞胰岛素分泌功能,ELISA法检测胰岛素水平。结果:经镜下筛选后每只小鼠纯化后获得的胰岛数为195.00±14.95 IEQ/只,纯度>90.00%;双硫腙(DTZ)染色后胰岛细胞团呈现猩红色,AO/PI染色后显示,分离的胰岛细胞团内活细胞比例超过95.00%;胰岛素分泌功能检测结果为,高糖刺激下,分离的胰岛释放胰岛素含量(23.00±3.90 ng.ml-110islet-1.45min-1)为低糖浓度(10.10±1.40 ng.ml-110islet-1.45min-1)刺激下的2倍以上,说明分离胰岛具有较高的胰岛素释放能力。结论:胰管十二指肠开口处逆行插管进行消化液灌注与传统的胆总管插管灌注相比可降低因胆管走形较长而出现的刺破胆总管风险,提高手术成功率,Histopaque-1077溶液与Hanks溶液进行密度梯度离心操作简单,提高了实验效率,实验结果证实分离的胰岛功能良好,可用于各项胰岛相关实验。第二部分小鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养及鉴定目的:探索小鼠骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)原代分离培养方法,鉴定BM-MSCs的生物学特性并为进一步实验提供基础。方法:小鼠消毒处理后分离双侧股骨及胫骨,抽取骨髓腔内骨髓于培养皿中培养,每日于倒置显微镜下观察细胞形态及数量等生长情况。取指数期生长的BM-MSCs细胞,以CD29、CD117、CD44、CD31、Sca-1为细胞特异性标记进行流式细胞仪检测鉴定。结果:每只小鼠平均BM-MSCs获得率为(5.35±0.40)×105个/只,细胞培养状态良好,细胞特异性表达CD29(阳性率96.04%)、CD44(阳性率96.21%)及Sca-1(阳性率95.72%),不表达CD117(阳性率0.13%)及CD31(阳性率0.23%)。结论:全骨髓培养法分离小鼠骨髓间充质干细胞操作较为简单,BM-MSCs获得率高,培养后细胞状态良好,为后续的实验奠定基础。第三部分骨髓间充质干细胞对同种异体胰岛移植物的保护作用及机制目的:研究BM-MSCs联合胰岛移植对胰岛移植物的保护作用,及BM-MSCs对Tfh的调节作用并诱导胰岛移植免疫耐受的机制。方法:实验动物共分为5组。A组(Group A)NOD正常血糖组(非手术组);B组(Group B)糖尿病组(非手术组);C组(Group C)单纯胰岛移植组;D组(Group D)胰岛细胞与BM-MSCs共同移植组;E组(Group E)BM-MSCs尾静脉注射+BM-MSCs/胰岛联合移植组。手术方式为肾包膜下胰岛移植,移植术后检测血糖变化,术后第7天行糖耐量检测。取术后第7天各组小鼠脾脏及外周血行ELISA法检测各组中糖尿病自身抗体GAD65Ab、IAA表达水平,流式细胞仪检测各组外周血及脾脏Tfh细胞水平,Western blot发检测ICOS及Bcl-6表达水平,取移植处肾脏组织行HE染色,免疫组化及免疫荧光染色,观察移植物形态及胰岛素分泌情况。结果:D组(23.67±2.77天)和E组(34.00±4.51天)受鼠平均生存时间较C组(11.67±2.27天)明显延长;C、D、E组受鼠分别从第14.0天、26.0天及42.0天开始表现为移植胰岛功能失活,差异显著;术后第2天C组出现明显低血糖(3.5±1.3 mmol/L),而D组(6.5±1.4 mmol/L)和E组(7.1±1.4 mmol/L)血糖仍在正常范围(5.0~20.0 mmol/L)内;术后第7天糖耐量检测实验结果显示,三个移植组较糖尿病组均有较好的血糖控制,而血糖峰值D组(18.4±0.9 mmol/L)和E组(18.0±0.7 mmol/L)较C组(21.8±1.3 mmol/L)血糖控制更稳定,D组和E组两组之间血糖控制差异不显著;受体血清中糖尿病自身抗体GAD65(A:0.40±0.02;B:1.49±0.03;C:1.20±0.09;D:0.82±0.03;E:0.42±0.03 OD 450nm)及IAA(A:0.31±0.03;B:1.31±0.06;C:1.03±0.07;D:0.70±0.04;E:0.32±0.03 OD450nm)水平差异显著,CD4+CXCR5+Tfh细胞比例分别为A组(4.35±1.54%)、B组(24.55±5.41%)、C组(23.87±6.67%)、D组(9.67±1.34%)及E组(4.27±0.59%),Western blot检测ICOS及Bcl-6表达D组和E组较B组和C组明显降低,差异显著;三手术组移植物病理学检测结果显示:与C组合D组相比,E组胰岛移植物形态更为完整,胰岛融合不明显,淋巴细胞侵润较少,胰岛素分泌水平较高。结论:BM-MSCs通过调节Tfh细胞比例,降低体内糖尿病自身抗体水平,从而起到诱导胰岛移植免疫耐受的效果,对胰岛移植物起到保护作用;且BM-MSCs尾静脉注射+BM-MSCs/胰岛联合移植的方案较单纯胰岛移植及BM-MSCs联合胰岛移植的方案更为有效。