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脓毒症是急性肝损伤(Actue Liver Injury,ALI)发生的主要原因之一,高胆红素血症、血清胆汁酸水平升高常提示肝脏胆汁淤积形成,是脓毒症肝损伤的主要临床表现。脓毒症肝损伤发生发展的机制尚无定论,如何防治脓毒症肝损伤成为重症医学的研究热点。本研究第一部分采用腹腔注射脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)的方法构建内毒素血症肝损伤小鼠模型,探究肝脏胆汁酸转运体钠离子/牛磺胆酸共转运蛋白(sodium taurocholate cotransporting polypeptide,Ntcp)和胆盐输出泵(bile salt export pump,Bsep)mRNA动态表达变化及与肝损伤程度的关联。第二部分给予内毒素血症肝损伤小鼠不同剂量(2mg/kg、20 mg/kg)甲基强的松龙(简称甲强龙,Methylprednisolone,MP)进行干预,探究糖皮质激素对内毒素血症肝损伤小鼠肝脏胆汁酸转运体Ntcp、Bsep表达及肝功能的影响,进一步探讨糖皮质激素对脓毒症相关性肝损伤的保护机制。第一部分:内毒素对小鼠胆汁酸转运体Ntcp mRNA和Bsep mRNA表达及肝功能的影响【目的】探讨LPS建立内毒素血症小鼠模型中,LPS剂量和作用时间对肝脏胆汁酸转运体Ntcp mRNA、Bsep mRNA表达,以及血清总胆红素(total bilirubin,TBIL)、总胆汁酸(total bile acid,TBA)、谷丙转氨酶(alanine aminotransferase,ALT)、谷草转氨酶(aspartate aminotransferase,AST)水平的影响。【方法】128只雄性C57BL/6J小鼠,腹腔注射LPS(剂量分别是5、10、20、40 mg/kg),制作内毒素血症模型;并设生理盐水(NS)对照组、正常对照组;按给药后取材时间进一步分为24 h、48 h、72 h组,每组8只。留取小鼠血液样本测定血清TBIL、TBA、ALT、AST水平,留取肝脏标本,实时荧光定量聚合酶链反应技术(RT-qPCR)测胆汁酸转运体Ntcp mRNA和Bsep mRNA表达量,苏木精-伊红(HE)染色观察肝组织病理学变化。各组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD-t检验进行统计。【结果】(1)内毒素血症各组小鼠Ntcp mRNA、Bsep mRNA相对表达量在24-72 h内下降,24 h表达最低(LPS 5、10、20、40 mg/kg组Ntcp mRNA相对表达量分别为0.64±0.02、0.53±0.14、0.25±0.09、0.15±0.07,Bsep mRNA相对表达量分别为0.74±0.12、0.58±0.11、0.41±0.09、0.27±0.11),并随着LPS剂量增加逐渐降低,24 h各组差异均有统计学意义(Ntcp mRNA、Bsep mRNA对应F值分别为5.29、9.31,P值分别为0.04、0.02);(2)内毒素血症小鼠各组TBIL、TBA、ALT、AST较对照组均升高(P<0.05),24 h达峰值;(3)5 mg/kg、10 mg/kg LPS组小鼠24 h见肝组织疏松淡染,间质炎性细胞浸润,48 h及72 h见肝细胞嗜酸性变、空泡样变,炎性细胞浸润,胆小管增生;20 mg/kg、40 mg/kg LPS组小鼠各时间点均见肝组织结构改变,灶性坏死,间质炎症细胞浸润,胆小管增生、扩张。【结论】内毒素血症肝损伤模型24 h时即Ntcp mRNA和Bsep mRNA表达下调,且随LPS剂量增加加重,可能是内毒素肝损伤的重要机制。第二部分:甲基强的松龙对内毒素血症小鼠肝脏NTCP、BSEP表达与肝损伤的作用【目的】探索糖皮质激素对内毒素血症肝损伤小鼠肝脏胆汁酸转运体NTCP、BSEP表达及肝功能的影响。【方法】96只雄性C57BL/6J小鼠随机分为4组,生理盐水(NS)对照组、内毒素血症肝损伤(LPS)组、2 mg/kg甲强龙处理(LPS+2 mg/kg MP)组、20mg/kg甲强龙处理(LPS+20 mg/kg MP)组;按取材时间进一步分为24 h、48 h、72 h组,每组8只。留取小鼠血清样本测定TBIL、TBA、ALT、AST水平,留取肝脏标本,实时荧光定量聚合酶链反应技术(RT-qPCR)测Ntcp、Bsep、IL-6、TNF-α的mRNA表达水平,免疫蛋白印迹法(western blot)测定NTCP、BSEP蛋白表达水平,苏木精伊红(HE)染色观察肝组织病理学变化。【结果】(1)LPS处理后小鼠出现内毒素血症症状,24 h时表现最严重;LPS+2 mg/kg MP组和LPS+20 mg/kg MP组小鼠症状较LPS组轻。(2)LPS处理后小鼠血清TBIL、TBA、ALT、AST水平较NS组均显著上升(P<0.05),2 mg/kg和20 mg/kg两种剂量MP干预均能使升高的TBIL、TBA、ALT、AST水平有所下降(P<0.05)。(3)LPS处理后24 h即可见小鼠肝组织结构改变,间质炎性细胞浸润、肝细胞嗜酸性变、空泡样变,炎性细胞浸润,胆小管增生、扩张等;与LPS组相比,LPS+2 mg/kg MP组和LPS+20 mg/kg MP组肝组织病理损伤均有不同程度改善。(4)LPS处理后小鼠Ntcp mRNA、Bsep mRNA较NS组下调,2 mg/kg和20mg/kg两种剂量MP处理均能改善LPS对Ntcp mRNA、Bsep mRNA表达的抑制作用,且20 mg/kg MP在24 h、48 h组对Ntcp mRNA及在24 h组对Bsep mRNA表达的改善效果强于2 mg/kg MP(P<0.05)。(5)LPS处理24 h后,NTCP、BSEP蛋白表达明显被抑制,2 mg/kg和20 mg/kg MP处理均能改善LPS对NTCP、BSEP表达的抑制作用,且20 mg/kg MP对NTCP表达的逆转效果强于2 mg/kg MP(P<0.05)。(6)LPS处理后IL-6 mRNA、TNF-αmRNA较NS组表达显著上调,2 mg/kg和20 mg/kg两种剂量MP处理均能显著下调LPS对IL-6、TNF-αmRNA表达的促进作用(P<0.05),且20 mg/kg MP在24-72 h组对IL-6 mRNA表达的下调成程度均强于2 mg/kg MP(P<0.05)。【结论】甲强龙对小鼠内毒素血症急性肝损伤有保护作用,可能与上调肝脏胆汁酸转运体NTCP、BSEP表达有关。