牛人工授精后早期阶段的妊娠识别和妊娠建立对于成功妊娠并产犊具有决定作用,早期妊娠诊断可以及时鉴别妊娠牛和空怀牛,有助于妊娠牛的精细化管理和空怀牛的复配,对于提高牛群的繁殖力具有重要意义。但截至目前,牛繁殖力性状相关的候选基因鉴定比较有限,妊娠早期的分子调控机制尚不甚清楚,精准、简便、快捷的早期妊娠诊断技术开发在牛业生产中显得十分迫切。基于此,本研究在对妊娠牛与妊娠失败牛生理生化和免疫相关指标充分比较分析的基础上,利用转录组测序和定量蛋白质组学技术对参与早期妊娠的关键候选基因和蛋白进行了筛选鉴定,探讨了它们介导妊娠识别和妊娠建立的分子调控机制,初步对基于干扰素刺激基因的牛早期妊娠诊断技术体系进行了研究。研究为深入解析牛早期妊娠的分子调控机制提供了理论依据,为新的牛妊娠诊断生物标志物开发应用提供了技术支撑,为高繁殖力牛群的分子遗传繁育奠定了基础。内容如下:1、早期妊娠阶段水牛血液参数表型分析与候选基因筛选(1)妊娠水牛与空怀水牛血液激素水平、血细胞五分类与细胞因子水平分析比较分析了29头实验牛(6头妊娠水牛,23头空怀水牛)于早期妊娠阶段的血液参数(血细胞五分类、孕酮、细胞因子),发现:人工授精后18d至30d,妊娠水牛外周血单核细胞(MONO)绝对值和百分比均显著高于0d,人工授精后23d妊娠水牛MONO百分比显著高于空怀水牛;人工授精后14d妊娠水牛嗜酸性粒细胞(EOS)绝对值和百分比显著高于0d,但与空怀牛无显著差异。人工授精后14d至30d,妊娠水牛孕酮均显著高于空怀水牛。妊娠水牛孕酮与淋巴细胞(LYMPH)百分比呈中等负相关,与EOS绝对值以及百分比呈较强正相关。人工授精后0d至20d,妊娠水牛IFN-γ、TNF-α以及IL-1α的表达水平总体上呈下降趋势,IL-13以及IL-10总体上呈上升趋势,但与0d相比差异不显著;人工授精后18d妊娠水牛血液中ANG-1的表达水平极显著高于0d。结果提示,妊娠早期血液中MONO百分比、孕酮以及ANG-1含量的增加有助于妊娠建立。(2)水牛早期妊娠阶段的候选基因筛选对4头妊娠水牛人工授精后0d、14d、18d、20d这4个时间点的外周血液白细胞进行了转录组测序分析,共鉴定到相对于0d的差异表达基因(DEGs)74个,其中人工授精后18d的DEGs最多(52个),为血液细胞转录组变化最为显著的时间点,而且18d转录组的差异情况与IFNT的水平变化同步。经典信号通路分析表明,人工授精后18d血液中差异基因主要参与介导干扰素信号通路(IFI6、IFIT1、IFITM3、ISG15、MX1以及OAS1)和被胞质模式识别受体激活IRF信号通路等;功能富集分析结果显示,HBA1/HBA2、HBB、NUPR1、IFIT1、IFIT3、ITGA4以及ISG15是早期妊娠阶段参与调节胚胎发育以及繁殖系统发育与功能的关键候选基因。2、妊娠识别标志基因在奶牛早期妊娠诊断中的应用研究结合前期研究,进一步利用荧光定量PCR技术对人工授精后0d至28d妊娠奶牛(n=11)和空怀奶牛(n=8)外周血中ISG15、OAS1和RSAD2基因的表达进行了检测。通过扩大分析群体(妊娠牛19头,空怀牛17头),用受试者工作曲线(ROC)系统评估了单独或联合利用这3个基因的表达进行妊娠诊断的效果。最后,对准确性最高的组合通过设计荧光探针引物和双重荧光定量PCR技术进行了妊娠诊断的检测效果评估。结果表明,人工授精后18d妊娠奶牛外周血中ISG15、OAS1和RSAD2基因的表达量均显著高于空怀奶牛;3个基因单独或联合应用于早期妊娠诊断时,RSAD2单基因的敏感性(即灵敏性)为100%,特异性为88.2%;ISG15与RSAD2基因联合应用的敏感性为94.7%,特异性为100%。双重定量PCR扩增的结果显示:尽管ISG15基因单独应用于妊娠诊断的敏感性为100%,但特异性仅为88.2%(截断值为1.402);RSAD2基因单独应用的敏感性为89.5%,特异性为88.2%;二者联合应用于妊娠诊断的敏感性、特异性以及诊断的临界值与单重定量PCR一致。本研究初步建立了基于双重荧光定量PCR的早期妊娠诊断技术体系。3、早期妊娠阶段牛血清差异蛋白表达谱与关键候选蛋白筛选研究利用标记与定量蛋白质组学技术(i TRAQ),结合IPA~?生信分析以及RT-q PCR、Western blot等技术,共获得早期妊娠阶段(人工授精后28d之内)奶牛血清中的差异表达蛋白114个,其中妊娠牛血清中特有的差异蛋白64个,空怀牛血清中特有的差异蛋白33个,妊娠牛和空怀牛血清中共有的差异蛋白17个。对妊娠牛和空怀牛在人工授精后不同时间点的蛋白质表达谱进行了比较分析,构建了妊娠牛与空怀牛血清中的蛋白质表达谱。其中,参与胚胎发育、繁殖系统发育与功能改变的差异蛋白28个。研究基于hub protein筛选结果进一步采用Western blot技术对其中的部分关键蛋白(EFEMP1、CD44、KRT18、NRF2和BRCA2)进行了验证,结果与i TRAQ检测一致,可以作为奶牛妊娠诊断的候选生物标志物。4、关键候选基因介导牛早期妊娠的分子机制以牛子宫内膜上皮细胞为研究模型,采用si RNA技术抑制NRF2表达24h至96h后检测细胞增殖以及HO-1、HOXA10基因的表达情况。结果显示,NRF2抑制表达后导致细胞增殖能力明显减弱,HO-1以及HOXA10在m RNA和蛋白水平均显著下调。研究进一步结合IFNT刺激和si RNA抑制实验对未折叠蛋白反应(unfolded protein response,UPR)通路相关基因表达进行了分析,结果表明:牛子宫内膜上皮细胞经IFNT刺激后,NRF2以及内质网应激反应相关基因(GRP78、CHOP、PERK和ATF6)的表达量显著上调,提示IFNT可诱导牛子宫内膜上皮细胞发生ERS,并通过激活ATF6和PERK来引发UPR;而si RNA抑制NRF2表达后,牛子宫内膜上皮细胞中IFNT诱导的UPR被抑制,并导致CHOP基因的转录水平显著上调,BCL2与BAX m RNA的表达量以及表达量的比值显著下降,并导致细胞凋亡发生。因此推测,NRF2可能通过UPR通路参与IFNT调节的牛母体妊娠识别过程。