抗菌肽是生物体产生的一种阳离子小分子肽，多数具有广谱抗菌活性，是生物先天性免疫的重要组成成分。目前，已在许多生物体内，包括：昆虫、鸟类、动物、植物及原核生物中发现1000多种具有抗菌活性的肽。抗菌肽的制备方法主要有生物材料提取法、化学合成法和基因工程表达法3种。由于抗菌肽在生物组织中含量低、分离提取困难，除少数几种昆虫抗菌肽外，提取法难以满足生产应用的需要，仅用于氨基酸序列分析和初步的抗菌试验。化学合成法可以提高产量，但差错率和副反应随分子量增大而增加，一般超过50个氨基酸残基的肽段即难以用化学法合成，并且化学合成法成本很高，所以，仅用于结构和性质分析及药理实验，难以应用于实际生产。由于抗菌肽结构简单、氨基酸残基未被翻译后修饰，因此，基因工程表达法是大量生产抗菌肽的理想途径。现在，已有很多阳离子抗菌肽成功的用基因工程进行了表达，如magainins、杀菌肽、buforins及其模拟肽。由于抗菌肽基因一般都较小，故采用人工合成的方法来获取目的基因，再通过基因工程方法进行微生物发酵生产抗菌肽则更具有实际意义。因此，本研究以β-防御素-3(HBD-3)为研究对象，应用基因工程技术研制出重组HBD-3，并将重组HBD-3在毕赤酵母表达系统进行表达，研究其抗菌活性，为重组抗菌肽的产业化奠定基础。　　 研究目的　　 1.应用DNA重组技术构建抗菌肽HBD-3高效表达载体，诱导表达出具有抗菌活性的重组抗菌肽。　　 2.分析抗菌肽的热稳定性、抑菌活性等特性，为抗菌肽的活性研究和应用提供科学依据。　　 研究方法　　 1.HBD-3基因的克隆鉴定：将人工合成的HBD-3基因利用酶切、连接，克隆到真核表达载体pGAPZαA中，构建成重组质粒HBD-3-pGAPZα，进行测序鉴定；将重组质粒其转入E.coli感受态细胞JM109，扩增质粒，筛选阳性克隆，挑选单菌落进行PCR检测。　　 2.HBD-3蛋白表达与鉴定：提取测序正确的E.coli JM109进行增菌培养，大量提取质粒；用BspA I进行单酶切，线性化重组载体，将重组载体电转化至毕赤酵母SMD1168感受态细胞，用PCR进行检测鉴定；在GAP启动子调控下，诱导表达重组HBD-3，通过Tricine-SDS-PAGE鉴定重组HBD-3蛋白表达情况。　　 3.应用琼脂孔扩散法对重组抗菌肽HBD-3的活性进行检测：将处于对数生长期的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的悬浮液与LB固体培养基混匀后铺板，等其凝固后，用打孔器打孔，滴加重组的HBD-3表达上清，37℃培养，过夜，以同体积pGAPZαA空载体转化SMD1168酵母表达蛋白为对照，同时加入等体积的重组抗菌肽(Grahamin1、Grahamin2、Astacidin2、LL-37、HNP1、HsAFP1)作为对照，第2天测量抑菌直径。　　 4.重组HBD-3最小抑菌浓度测定：将处于对数生长期的金黄色葡萄球菌，分别接种到96孔细胞培养板上，将不同浓度的重组HBD-3加入培养孔，混匀，置37℃培养箱孵育24h后，用紫外分光光度计测量重组抗菌肽HBD-3的最小抑菌浓度。　　 5.重组HBD-3热稳定性测定：将重组抗菌肽HBD-3经过不同时间的沸水浴后进行抑菌试验，观察其对金黄色葡萄球菌抗性的变化，同时以pGAPZαA空载体转化酵母的表达上清和未煮沸的HBD-3抗菌肽作对照。　　 研究结果　　 1.成功构建HBD-3-pGAPZαA重组质粒，通过PCR挑选阳性克隆并测序，结果表明，所合成的重组质粒与设计序列完全一致。　　 2.通过1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果表明，线性化的重组质粒成功电转化到毕赤酵母SMD1168感受态细胞中。在GAP启动子调控下，重组HBD-3在毕赤酵母中得到表达。Tricine-SDS-PAGE对重组HBD-3的鉴定结果表明，重组HBD-3的分子量约为5.0KD。　　 3.应用琼脂孔扩散法对重组抗菌肽的活性进行检测，结果表明，重组HBD-3对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度为5μg/ml；重组HBD-3的热稳定性较好，100℃20min不能破坏HBD-3的抑菌活性。　　 结论　　 1.成功构建了重组表达载体HBD-3-pGAPZαA，在毕赤酵母SMD1168中获得高效表达。　　 2.HBD-3重组表达蛋白具有较好的耐热性能，对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度为5μg/ml，为后续研究奠定了基础。