【摘 要】
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为深入研究Bid诱发凋亡的机制,进一步阐明其在凋亡途径中的作用,采用酵母双杂交系统,将t-Bid作为诱饵蛋白表达在寄主菌株AH109中,与预转染的骨髓瘤文库杂交,筛选与t-Bid相互
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为深入研究Bid诱发凋亡的机制,进一步阐明其在凋亡途径中的作用,采用酵母双杂交系统,将t-Bid作为诱饵蛋白表达在寄主菌株AH109中,与预转染的骨髓瘤文库杂交,筛选与t-Bid相互作用的蛋白.从约5×10<6>个杂交菌株中筛选到10个阳性克隆.测序结果经NCBI网站GenBank数据库比较分析得出四个基因片段,它们分别编码Mcl-1、Bid、CHDH、FHL2四种蛋白.证明在酵母菌株中,t-Bid与这四种蛋白之间存在着相互作用.随后采用免疫共沉淀(Coimmunoprecipitation,CO-IP)方法验证Mcl-1与tBid在哺乳动物细胞中是否存在相互作用.将Mcl-1和tBid两种基因分别克隆到pCMV-HA和pCDNA-3.1-myc-His两种真核载体中,再将它们共转染到Hela细胞中,用anti-His抗体和protein G PLUS将蛋白从细胞裂解物中沉淀出来,再用anti-HA抗体进行免疫沉淀物的Western blot分析,结果显示,在哺乳动物细胞中Mcl-1和tBid这两种蛋白之间存在着相互作用.利用t-Bid作为"诱饵"筛选出的与之相互作用的线粒体通道蛋白,极有可能作为抗癌药物靶蛋白,为阐明细胞凋亡的分子机理、Bid在细胞凋亡途径中的作用和应用于临床的抗癌药物的开发打下基础.
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