论文部分内容阅读
禽致病性大肠杆菌(Avian pathogenic Escherichia coli,APEC)被证明不仅能够感染禽类,还可以感染哺乳动物(包括人),这表明禽致病性大肠杆菌是人兽共患病的潜在病原体。PhoP/Q是APEC中调控关键毒力因子的重要二元调控系统,其对APEC诱导机体内防御反应起重要作用。禽β-防御素(Avianβ-defensins,AvBDs)抗菌能力强、抗菌谱广、作用机制独特,已然成为生物医学领域当前的研究热点。禽β-防御素6(AvBD6)在禽类先天宿主防御系统中起重要作用,其在消化道内表达量较高,且抗微生物活性较为广泛。目前,有关PhoP/Q二元调控系统与机体内防御素的相互作用,尚未见报道。因此,为了探讨雏鸡在感染APEC及其PhoP/Q缺失株过程中,肠道内AvBD6的表达与分布情况,本研究用APEC及其PhoP/Q缺失株感染14日龄的雏鸡(罗曼鸡),构建感染雏鸡肠道模型,并观察病理变化。菌液感染雏鸡后,分别于不同时间点采取各段小肠组织,利用FQ-PCR检测AvBD6 mRNA在小肠组织的转录水平,免疫组化技术检测AvBD6蛋白在小肠组织的分布规律。开展本实验为研究AvBDs在抗APEC感染中的应用奠定基础,同时也为揭示PhoP/Q二元调控系统对APEC感染鸡后诱导AvBDs抗感染的调控作用机理提供理论依据。具体研究内容和结果如下:1.APEC及其PhoP/Q缺失株感染雏鸡肠道及其病理变化经腿肌分别接种浓度为1×106 cfu/mL的APEC菌液和APEC PhoP/Q缺失株菌液0.5 mL(空白对照组用PBS代替),分别建立APEC感染雏鸡和APEC PhoP/Q缺失株感染雏鸡模型,并观察病理变化。结果显示雏鸡在接种APEC及其PhoP/Q缺失株48 h时出现典型病变,即肠粘膜肿胀,甚至出现血管破裂出血,形成出血性肠炎。小肠绒毛上皮组织脱落,杯状细胞被溶解,绒毛中心轴部位红细胞和炎性细胞数量增加。2.雏鸡感染APEC及其PhoP/Q缺失株后小肠组织AvBD6 mRNA的表达14日龄的罗曼鸡分别接种APEC和APEC PhoP/Q缺失株菌液,于感染后0 h、6h、12 h、24 h、36 h和48 h采集小肠组织(包括十二指肠、空肠和回肠),应用FQ-PCR方法检测雏鸡在感染过程中肠道内AvBD6 mRNA的转录水平。结果显示雏鸡感染APEC及其PhoP/Q缺失株24-48 h,小肠各段AvBD6 mRNA表达量表现为:PhoP/Q缺失株攻毒组>APEC攻毒组>空白对照组;AvBD6 mRNA表达量于48 h达到峰值且显著高于其余各时间段(P<0.05);空白对照组中雏鸡十二指肠和空肠的AvBD6mRNA相对表达量最高,且在0-48 h内基本呈水平态势;感染0-48 h时,APEC攻毒组雏鸡空肠AvBD6 mRNA转录量相对较高;APEC PhoP/Q缺失株感染雏鸡48 h内十二指肠AvBD6 mRNA转录量显著高于空肠和回肠(P<0.01或P<0.05)。3.雏鸡感染APEC及其PhoP/Q缺失株后小肠组织AvBD6蛋白的表达根据FQ-PCR的检测结果,于感染48 h时采集各组十二指肠、空肠和回肠组织,运用免疫组化方法检测雏鸡在感染APEC及其PhoP/Q缺失株时AvBD6在肠道中的蛋白表达情况。结果显示,AvBD6蛋白在各组小肠内均有不同程度的分布,在攻毒组雏鸡小肠各段的绒毛上皮细胞和十二指肠中的类十二指肠腺、空肠及回肠的肠腺部分有不同程度的分布。AvBD6蛋白在小肠组织内的阳性信号呈棕黄色。利用Image-pro plus 6.0软件对各组织切片的平均光密度值进行检测,用其代表AvBD6的蛋白相对表达量,结果显示APEC攻毒组和PhoP/Q缺失株攻毒组同肠段AvBD6的蛋白相对表达量较空白对照组显著升高(P<0.01或P<0.05)。以上试验结果表明,14日龄罗曼雏鸡在感染APEC及其PhoP/Q缺失株后,AvBD6 mRNA在鸡小肠各段的分布和表达具有一定规律性,在感染48 h内AvBD6mRNA的表达水平在48 h时最高,且表达量大小关系为PhoP/Q缺失株攻毒组>APEC攻毒组>空白对照组。在相同条件下,APEC攻毒组及PhoP/Q缺失株攻毒组各肠段AvBD6蛋白含量较空白对照组含量升高,且差异显著说明AvBD6起到了抗APEC感染的作用,且PhoP/Q可能参与APEC调控AvBD6的抗感染作用。