【摘 要】
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目的:肛门直肠畸形（Anorectal malformations,ARM）是儿外科多见的先天畸形,发病几率在1/5000-1/1500,手术可以治疗大部分与ARM相关的疾病,但术后长期并发症影响患儿的生长发育及生活质量,因此探究ARM发病机制十分重要。目前的研究主要注重在基因表达的水平,需要更加深入研究基因对ARM的具体调控机制。因此前期研究将乙烯硫脲（Ethylenethiourea,ETU）
【基金项目】
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国家自然科学基金资助项目（NO.818671503）； 盛京医院345人才计划项目基金；
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目的:肛门直肠畸形（Anorectal malformations,ARM）是儿外科多见的先天畸形,发病几率在1/5000-1/1500,手术可以治疗大部分与ARM相关的疾病,但术后长期并发症影响患儿的生长发育及生活质量,因此探究ARM发病机制十分重要。目前的研究主要注重在基因表达的水平,需要更加深入研究基因对ARM的具体调控机制。因此前期研究将乙烯硫脲（Ethylenethiourea,ETU）诱导先天性肛门直肠畸形大鼠胚胎模型的末端后肠组织进行了高通量测序,从结果中筛选出差异表达的lncRNA ENSRNOT00000093006.1,探究其在正常组和畸形组的表达改变,并且改变表达（过表达/干扰）后,研究该lncRNA ENSRNOT00000093006.1在大鼠小肠隐窝上皮细胞中的功能变化,进而研究它对疾病发生发展的影响。研究方法:①造模（动物模型）和取材。Wistar大鼠共30只,雌雄大鼠以4:1比例晚上合笼,第二天早上进行阴道涂片,看到精子或阴道栓时定义为妊娠0天（GDO,gestational day 0）。随机把孕鼠分成ARM组和正常组,在GD10时灌胃给药,ARM组给予ETU（生理盐水溶解,125mg/kg）,正常组给予相同量生理盐水。GD16、GD17、GD19时取出胎鼠,ARM组胎鼠存在肛门闭锁、短尾或无尾畸形,正常组胎鼠尾部及肛门开口正常。GD16、GD17通过显微镜观察,GD19可在肉眼下观察胎鼠骶尾部形态,无菌取出胎鼠的后肠组织,并统计致畸率。②用qRT-PCR技术检测ARM组和正常组胎鼠后肠组织中的lncRNA ENSRNOT00000093006.1表达水平差异,通过核质分离,qRT-PCR验证lncRNA ENSRNOT00000093006.1在核内外的表达水平差异进行初步定位。③采用lncRNA ENSRNOT00000093006.1的特异性干扰序列siRNA及过表达质粒下调或上调IEC-6细胞中其表达,通过CCK-8（Cell Counting Kit-8）测定细胞增殖水平,流式细胞技术检测细胞凋亡水平。④Western blot检测干扰及过表达IEC-6细胞中的lncRNA ENSRNOT00000093006.1后提取的细胞总蛋白中Wnt5a蛋白的表达水平变化。⑤统计学分析,qRT-PCR结果用2-△△CT表示相对表达量,Western blot条带用ImageJ软件进行半量分析,实验数据用Prism 8.0进行分析,每个实验都设置三个生物学重复,两样本比较采取独立样本T检验,P<0.05时认为结果差异具有统计学的意义。结果:①ARM组的胎鼠对比于正常组的胎鼠,在GD16、GD17、GD19时lncRNA ENSRNOT00000093006.1表达下调,其中GD16、GD19时下调显著,而且差异具有统计学意义（P<0.01）;②lncRNA ENSRNOT00000093006.1 在IEC-6细胞浆及细胞核中表达一致,差异无统计学意义（P>0.05）;③干扰lncRNA ENSRNOT00000093006.1表达后抑制细胞增殖,促进细胞凋亡（P<0.01）,过表达lncRNA ENSRNOT00000093006.1表达后促进细胞增殖,抑制细胞凋亡（P<0.01）;④干扰lncRNA ENSRNOT00000093006.1 表达后,Wnt5a蛋白表达下降（P<0.01）,过表达lncRNA ENSRNOT00000093006.1 表达后,Wnt5a蛋白表达增加（P<0.01）。结论:综上所述,本研究通过动物实验验证lncRNA ENSRNOT00000093006.1在大鼠肛门直肠组织中ARM组较正常组表达下调,细胞实验验证干扰IEC-6细胞中lncRNA ENSRNOT00000093006.1的表达可抑制细胞增殖,促进细胞凋亡,抑制Wnt5a的表达来参与ARM的发生发展。
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