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目的:原发性肝细胞癌（Hepatocellular Carcinoma,HCC）是一种恶性程度极高,预后极差的恶性肿瘤。据最新全球癌症相关死亡统计,HCC死亡率男性位于第五位,女性位于第七位。我国因为乙肝和黄曲霉素病因,HCC的死亡率位于恶性肿瘤第二位。肿瘤血管生成导致肝癌具有进展迅速、高侵袭性、全身化疗不敏感等特点。临床上对于不可手术切除的肝癌患者,药物治疗仍以靶向血管内皮生长因子（Vascular Endothelial Growth Factor,VEGF）及其受体的单抗（贝伐、雷莫芦单抗）、多激酶抑制剂（索拉菲尼、仑伐替尼等）和免疫检查点抑制剂（PD1、PD-L1）为主,但仅少部分患者获益。因此深入探究调控HCC血管新生的分子机制,挖掘新的治疗靶点及联合治疗新策略是临床亟需解决的关键科学问题。HIF-1α是肿瘤适应低氧微环境调控血管新生的中心环节,也是导致肿瘤恶性进展和治疗抵抗的关键因素。氨基酸代谢重编程是导致促癌代谢物异常积累是HCC恶性进展的重要原因,而目前氨基酸代谢异常调控HCC进展的确切机制尚不清楚。我们研究关注的是酪氨酸关键代谢酶谷胱甘肽硫转移酶Zeta1（glutathione S-transferases Zeta1,GSTZ1）,属于谷胱甘肽硫转移酶超家族成员之一,参与体内解毒,灭活氧化应激产物以及体内激素合成等功能。课题组前期通过TCGA数据库,临床组织标本以及HCC细胞系中验证发现GSTZ1在HCC中显著低表达,并且GSTZ1缺失导致致癌代谢物SA的明显积累。本研究以致癌代谢物异常积累角度为切入点,探索代谢物异常积累在肿瘤微环境中调控信号通路促进HCC血管生成及肿瘤进展的分子机制。方法:1)通过构建GSTZ1-KO Hep G2和对照组Parental细胞,模拟低氧肿瘤微环境,完善转录组测序,验证GSTZ1缺失后激活的信号通路;在HCC细胞其中通过WB,q RT-PCR,ELISA验证GSTZ1敲除及过表达VEGFA的表达;收集48对HCC临床组织样本及其对应癌旁组织,通过WB,IHC检测GSTZ1、HIF-1α、VEGFA分析表达差异及相关性,整理临床病理资料（包括患者年龄,肿瘤大小,肿瘤数目、有无血管侵犯等）,卡方检验分析GSTZ1与临床特征的相关性;从TCGA数据库分析GSTZ1、HIF-1α、VEGFA表达相关性,Kaplan-Meier生存曲线分析预后情况。2)体外体内实验观察GSTZ1在调控HCC血管生成中的作用:分别收集GSTZ1-KO Hep G2细胞和GSTZ1-OE Huh7细胞在常氧和低氧情况下的条件上清,观察在常氧及缺氧条件下对人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells,HUVECs）、人主动脉内皮细胞（human aortic endothelial cells,HAOECs）以及小鼠主动脉环进行孵育培养,通过侵袭、增殖实验,小管形成及主动脉发芽实验观察对血管生成能力的影响。体内观察DEN/CCL4 HCC模型GSTZ1敲除对血管新生及肿瘤进展的影响。3)在体内外采用抑制剂2-ME2或si RNA靶向抑制HIF-1α,通过WB,ELISA检测下游基因VEGFA的表达;使用Transwell侵袭实验、增殖实验以及小管形成观察在低氧微环境中抑制HIF-1α对HUVEC和HAOEC细胞血管生成能力的影响;采用BALB/c裸鼠（4-6周龄,雄性,20-25g）构建原位HCC模型:将混有基质胶的parental和GSTZ1-KO Hep G2细胞原位注射到肝叶,建立裸鼠原位成瘤模型,评价靶向HIF-1α对GSTZ1缺失引起HCC进展的影响。4)使用液相质谱检测GSTZ1-KO Hep G2和Parental细胞代谢物琥珀酰丙酮（Succinyl acetone,SA）浓度的变化,并分别采用外源加入SA以及NTBC减少SA,通过WB检测HIF-1α蛋白水平变化;通过胞浆胞核试验检测SA是否影响HIF-1α入核;在GSTZ1-KO Hep G2中使用NTBC干预SA或者在GSTZ1-OE Huh7细胞中恢复SA观察HUVEC和HAOEC细胞的侵袭迁移和小管形成能力。5)使用蛋白分子结构预测SA与PHD2的结合位点,并在肝癌细胞中应用药物亲和力实验,细胞热转移实验,表面等离子共振技术验证SA是否可以与PHD2结合,并通过WB,外源性PHD2酶活性实验验证代谢物SA对PHD2功能的影响。使用CO-IP实验SA是否影响PHD2与HIF-1α的相互作用;使用稳定性试验以及体外羟化实验验证GSTZ1缺失以及SA积累影响PHD2与HIF-1αODD结构域的相互作用。使用蛋白酶体抑制剂（MG-132）预处理Hep G2GSTZ1-/-及对照细胞,观察羟化HIF-1α-OH与总HIF-1α的表达水平的变化。进一步在GSTZ1基因敲除Hep G2细胞使用NTBC减少SA产生,观察羟化HIF-1α-OH与总HIF-1α的表达水平的变化。6)体外通过GSTZ1敲除小鼠DEN/CCL4 HCC模型验证靶向HIF-1α联合PD-L1对HCC的治疗效果;并且在临床组织芯片中验证GSTZ1与HIF-1α的关系,使用WB检测肝癌组织及癌旁的组织GSTZ1与HIF-1α的表达,以及检测代谢物SA在肝癌组织及癌旁组织的表达。结果:1)转录组测序发现GSTZ1缺失激活血管生成信号通路;通过临床组织标本,HCC细胞系及TCGA数据库验证发现GSTZ1与VEGFA的表达成负相关,生存分析发现GSTZ1低表达且VEGFA高表达的HCC患者预后最差。2)低氧条件下GSTZ1-KO组可促进HUVECs和HAOECs细胞的侵袭、增殖和小管形成,GSTZ1-OE组则有相反的实验结果,低氧条件下,GSTZ1-KO能促进C57小鼠主动脉发芽。3)在体外通过采用特异性抑制剂2-ME2或si RNA抑制HIF-1α,结果发现抑制HIF-1α可以抑制GSTZ1缺失引起的VEGFA表达增加;体内小鼠原位成瘤模型中发现靶向HIF-1α可以抑制GSTZ1缺失引起的小鼠肿瘤进展。4)液相质谱检测分析发现,代谢物SA的浓度在GSTZ1-KO组明显高于对照组;外源加入不同浓度的SA,HCC细胞的HIF-1α表达增加;SA促进HIF-1α的核转位;以及在GSTZ1-KO基础上使用NTBC减少SA,HIF-1α表达降低,在GSTZ1-OE的Hun7细胞中恢复SA,发现HIF-1α表达增加;功能学实验发现,在GSTZ1-KO Hep G2中使用NTBC干预SA观察HUVEC和HAOEC细胞的侵袭迁移和小管形成能力降低,在GSTZ1-OE Huh7细胞中恢复SA,HUVECs和HAOECs细胞的侵袭迁移和小管形成能力增加。代谢物SA是GSTZ1缺失引起HIF-1α增加的原因。5)我们通过DARTS,CETSA,SRP实验证实SA可以与PHD2结合,并通过WB和酶活性实验发现代谢物SA影响PHD2酶活功能而不是蛋白表达;使用CO-IP实验验证发现SA抑制PHD2与HIF-1α的相互作用;使用稳定性试验以及体外羟化实验证实GSTZ1缺失导致的SA积累抑制PHD2与HIF-1αODD结构域的相互作用。6)体外通过GSTZ1敲除小鼠DEN/CCL4 HCC模型验证发现靶向HIF-1α联合PD-L1显著抑制HCC的生长;GSTZ1敲除小鼠代谢物SA浓度显著高于野生型组;并且在临床组织芯片中验证GSTZ1与HIF-1α表达成负相关,代谢物SA在癌组织中表达明显高于癌旁组织。结论:本研究证实GSTZ1缺乏诱导物致癌代谢物SA异常积累,后者与α-KG竞争性结合PHD2并抑制PHD2对HIF-1α的羟化作用,导致HIF-1α表达增加最终促进肝癌血管生成及转移。此外,我们探索了靶向HIF-1α联合PD-L1在Gstz1-/-敲除小鼠中可有效抑制HCC血管生成和肿瘤进展,为HCC发病机制的探究和治疗策略的革新提供新的理论依据。