【摘 要】
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郏县红牛因具备肉质细嫩、色泽鲜红、大理石纹明显等特征,被认为是开发高档牛肉的优良素材。但由于郏县红牛生长发育速度慢、肉用性能不高,其比较效益与国际优良肉牛品种相比还有很大差距。提高其生产性能,对于提高郏县红牛养殖的经济效益具有重要意义。本研究利用多组学方法筛选出与郏县红牛生长性状相关的候选基因DNA聚合酶β(DNA polymerase beta,POLB),并在细胞水平对该基因进行功能验证。试验
【基金项目】
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河南省农业科学院科技创新创意项目:郏县红牛高效选育及配套技术研究(2020CX09); 河南省科技攻关计划项目:牛肌肉发育相关基因POLB启动子区缺失突变的功能验证及应用(222102110018); 河南省农业科学院优秀青年科技基金项目:河南地方肉牛品种肌肉发育关键基因的功能研究(2022YQ20);
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郏县红牛因具备肉质细嫩、色泽鲜红、大理石纹明显等特征,被认为是开发高档牛肉的优良素材。但由于郏县红牛生长发育速度慢、肉用性能不高,其比较效益与国际优良肉牛品种相比还有很大差距。提高其生产性能,对于提高郏县红牛养殖的经济效益具有重要意义。本研究利用多组学方法筛选出与郏县红牛生长性状相关的候选基因DNA聚合酶β(DNA polymerase beta,POLB),并在细胞水平对该基因进行功能验证。试验具体过程及结果如下:(1)郏县红牛肌肉生长发育相关候选基因的筛选为了筛选出与郏县红牛生长性状相关的主效基因,本研究利用选择性清除方法从郏县红牛和安格斯牛两品种间获得差异基因组区域并对区域内基因进行注释。利用Animal QTLdb数据库、Animal Omics Database数据库、郏县红牛和安格斯牛两品种间背最长肌转录组数据等对区域内基因进行综合分析。结果显示,利用选择性清除方法获得两品种间差异的基因组区域435个;将获得的差异基因组区域与Animal QTLdb数据库中与牛生长性状相关的QTLs进行比对,获得与生长性状QTL重合区域36个,并发现POLB基因位于牛日增重相关QTL内(QTL 69373);利用Animal Omics Database数据库分析发现POLB基因在牛骨骼肌中高表达(FPKM=23.79);转录组数据结果分析显示,POLB基因在郏县红牛背最长肌组织中的表达量显著高于在安格斯牛背最长肌组织中的表达量(P<0.01)。综上所述,筛选POLB基因为牛的肌肉发育相关的候选基因。(2)牛POLB基因SNP位点的检测及其与郏县红牛生长性状的关联分析为一步探究POLB基因与郏县红牛生长发育之间的关联性,本研究利用混池测序法对POLB基因序列全长进行单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism,SNP)扫描,并将所得SNP位点与100头郏县红牛的生长和体尺性状表型数据进行关联分析。结果显示,POLB基因起始密码子上游210 bp处存在1个12 bp缺失位点(c.-221_-210del),5’-UTR第101 bp处存在1个G>A突变位点(rs109209678),第8外显子第16 bp处存在1个C>T突变位点(rs1092096781)。其中c.-221_-210del突变位点的多态性与郏县红牛的体斜长显著相关(P<0.05)。在体重、体高、体斜长、腹围等性状中,c.-221_-210del突变位点的野生型牛均表现出高于缺失型牛的趋势。表明POLB基因可能与郏县红牛的生长发育相关。(3)过表达POLB基因对牛肌肉原代细胞的影响为探究POLB基因对牛肌肉原代细胞增殖、凋亡、周期的影响,本研究利用POLB基因腺病毒过表达载体(OE组)和阴性对照空载(NC组)侵染牛肌肉原代细胞,通过Realtime PCR、Western blot、CCK-8、流式细胞仪检测等技术方法,分析了OE组和NC组对牛肌肉原代细胞增殖、凋亡、周期影响的差异。结果显示,在牛肌肉原代细胞中过表达POLB基因,凋亡基因Caspase 9在mRNA(P<0.05)和蛋白(P<0.0001)水平表达量显著升高;侵染POLB基因腺病毒过表达载体48 h(P<0.01)和72 h后(P<0.05),细胞增殖被显著抑制;侵染POLB基因腺病毒过表达载体48 h,牛肌肉原代细胞凋亡率显著升高(P<0.05),且该细胞被阻滞在S期(P<0.05)。表明过表达POLB基因能够抑制牛肌肉原代细胞增殖,诱导细胞凋亡且能够上调凋亡基因Caspase 9,并将细胞阻滞在S期。综上所述,POLB基因与牛的生长发育相关,该基因的c.-221_-210del突变位点可作为辅助郏县红牛选育的潜在分子标记;在牛肌肉原代细胞内过表达POLB基因,该基因具有抑制肌肉细胞增殖、诱导细胞凋亡及影响细胞S期等作用。本研究为进一步探究POLB基因生物学功能与调控机理奠定基础。
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