铅是人类认识和研究的最古老的毒物之一,是常见的环境和生活污染物,可通过呼吸道、消化道、皮肤粘膜等途径进入体内,造成人体多种器官系统的损害,尤其是中枢神经系统,是其毒性作用的主要靶器官之一。随着人们对铅毒危害认识的不断深入,采取各种保护措施,高水平铅暴露所致的损害已经逐渐减少,但是来自环境和生活中低水平的铅暴露仍然十分常见。其中儿童由于血脑屏障未发育成熟等原因,比成人对铅的神经毒性更为敏感,较低水平的铅暴露即可造成儿童中枢神经系统的功能障碍。对于低水平铅暴露所致的儿童铅损伤尤其是神经系统损伤及其机制的研究,成为当今公共卫生研究领域的一个热点。学习和记忆是神经系统所具有的基本功能,也是最重要机能之一。海马是学习记忆的关键部位,亦是铅作用的敏感靶部位。铅有很强的发育神经毒性,即使是低水平的铅暴露,发育中的中枢神经系统也很容易受到铅毒性的损害。胎儿和婴幼儿期是脑发育的关键时期,在该时期接触到铅后,铅可以通过胎盘向胎儿转运,并通过胎儿发育尚不完善的血脑屏障,进入胎儿中枢神经系统,并对中枢神经系统的生长发育造成损害,进而影响胎儿出生后的学习记忆能力。在儿童接触铅的众多途径中,母体孕期铅暴露对胎儿脑发育的影响是十分重要的一个方面。研究表明发育早期铅暴露(怀孕/哺乳)所产生的认知和神经行为缺陷,在停止铅暴露后可能会持续影响到成年阶段。胚胎阶段的器官发生期和出生前后一段时期是中枢神经系统发育最迅速、也最易受到外来毒物损害的时期,处于围产期的胎儿或婴幼儿接受铅暴露后神经系统所受的损害可能较其它时期更为严重。但母体孕期低水平铅暴露对其子代中枢神经系统的损害及其机理缺乏深入而系统的研究。本研究采取大鼠孕期低水平铅暴露的方式,测定其子代血铅和海马组织铅的含量,并观察其子代学习记忆机能力的变化,探讨这种变化与铅接触之间的关系,为彻底揭示铅中毒的机理、优生优育和预防并降低儿童学习记忆的损伤,提供科学依据。第一部分大鼠孕期低水平铅暴露对子代大鼠血液和海马组织铅含量的影响目的:建立大鼠孕期低水平铅暴露的动物模型,观测大鼠孕期铅暴露后子代血铅和海马铅含量的变化,为分析学习记忆能力的改变与体内铅含量的关系,揭示铅影响学习记忆的机理打下基础。方法:Wistar大鼠受孕后随机分为4组,3个处理组自怀孕第1天起分别给予醋酸铅含量为125、250和500mg/L的饮水,对照组给予无铅蒸馏水;仔鼠出生后母鼠正常饮水、饮食,仔鼠由母鼠喂养至断乳后与母鼠分笼饲养;仔鼠出生1d时取全脑、21d和60d时取海马组织,采用流动注射氢化物发生-原子吸收光谱法进行铅含量测定。结果:孕鼠接触不同剂量铅后,各剂量组1d、21d龄的仔鼠血铅、海马组织铅含量显著高于对照组仔鼠,差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01),并且仔鼠血铅、海马组织铅含量与孕鼠铅暴露剂量之间有良好的剂量反应关系;至60d龄时,处理组和对照组仔鼠的血铅、海马组织铅含量无明显差异(P>0.05)。说明随着孕鼠铅暴露剂量的增加,进入仔鼠血液和海马组织内的铅也随之增加。结论:大鼠孕期低水平铅暴露,可使子代大鼠血液和脑组织中的铅含量增加,说明铅易于透过胎盘屏障和血脑屏障,引起子代血铅增高,并蓄积在脑组织中。宫内铅暴露后子代大鼠血铅和海马铅的增高至少可以持续到仔鼠的断乳期,至成熟期时,可下降至正常水平。第二部分大鼠孕期低水平铅暴露对子代大鼠学习记忆能力的影响目的:观察大鼠孕期铅暴露后对子代大鼠学习记忆能力的影响,并探讨这种改变与海马组织铅含量的关系,从而进一步判定铅对子代神经系统的毒性作用。方法:以Morris水迷宫、Y迷宫和避暗穿梭箱实验三种方法,观测仔鼠学习记忆能力的变化。结果:Morris水迷宫测试结果显示,各处理组21d和60d龄的仔鼠,连续4天训练期间,第2、3、4天时潜伏期均显著高于同期对照组仔鼠,差异有统计学意义(P<0.05, P<0.01)。避暗穿梭箱测试结果显示,各处理组21d和60d龄的仔鼠连续5天训练期间,主动回避次数低于同期对照组仔鼠,差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01);而主动回避潜伏期和被动回避潜伏期均高于同期对照组仔鼠,差异有统计学意义(P<0.05 or P<0.01)。Y迷宫测试结果显示,各处理组21d和60d龄的仔鼠,获取记忆的能力、保持记忆的能力和记忆保持率均低于同期对照组仔鼠,差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。综合分析海马铅含量和学习记忆能力之间的关系,海马组织铅含量越高,仔鼠的学习记忆能力越差;另外,各处理组仔鼠生长至成熟期(60d)时,血铅和海马铅含量已降至正常水平,但学习记忆能力仍显著低于对照组,未完全恢复,说明铅对仔鼠学习记忆能力的影响至少可持续到仔鼠的成熟期,学习记忆能力的恢复需要较长时间。结论:大鼠孕期低水平铅暴露,可以损害仔鼠的学习记忆能力,而且这种损害作用至少可以持续到仔鼠的成熟期;仔鼠的学习记忆能力与其海马组织的铅含量有关,铅含量越高,学习记忆能力受损越严重。第三部分大鼠孕期低水平铅暴露对子代大鼠学习记忆能力影响的机理研究目的:观察大鼠孕期铅暴露后,对子代大鼠海马组织细胞凋亡、胶质细胞、与生长相关因子情况的影响,并分析上述变化与仔鼠学习记忆能力受损的关系,探讨母体铅暴露对子代学习记忆能力影响的机理。方法:采用流式细胞技术和末端脱氧核糖核酸转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL),观察大鼠孕期铅暴露后仔鼠海马神经元细胞凋亡发生情况;免疫组织化学和Western blot技术检测海马星形胶质细胞胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)表达的变化,原位杂交和荧光定量PCR技术检测海马星形胶质细胞GFAP mRNA表达的变化;免疫组织化学和Western blot技术检测海马细胞神经生长相关蛋白(GAP-43)和神经生长因子(NGF)蛋白表达的变化,原位杂交和荧光定量PCR技术检测海马细胞GAP-43和NGF mRNA表达的变化;分析上述指标变化与学习记忆能力受损之间的关系。结果:大鼠孕期低水平铅暴露对子代大鼠海马细胞凋亡的影响:流式细胞检测结果显示,各处理组1d、21d和60d龄的仔鼠,海马细胞凋亡率显著高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01),并且各时间段细胞凋亡率与海马铅含量之间有良好的剂量反应关系;TUNEL法检测结果显示,1d龄的仔鼠,各处理组海马细胞凋亡指数均显著高于对照组,差异有统计学意义(P <0.05,P<0.01),21d和60d阶段,中、高剂量组海马细胞凋亡指数显著高于对照组(P <0.05,P<0.01),而低剂量组与对照相比未见显著性差异,各时间段仔鼠细胞凋亡指数与海马组织铅含量之间有良好的剂量反应关系;综合分析海马细胞凋亡与学习记忆能力之间的关系,海马细胞凋亡率或凋亡指数越高,仔鼠的学习记忆受损越严重,学习记忆能力越差。大鼠孕期低水平铅暴露对子代大鼠海马胶质细胞的影响:免疫组化和Western blot技术检测GFAP蛋白表达的结果显示,各处理组1d和21d龄的仔鼠,海马区GFAP免疫阳性反应阳性细胞平均数目、积分光密度和相对灰度值,显著高于同期对照组仔鼠(P <0.05,P<0.01),并与海马组织铅含量有良好的剂量反应关系,至60d时,未见显著性差异。原位杂交和荧光定量PCR技术检测GFAP mRNA表达的结果显示,各处理组1d和21d龄的仔鼠,海马GFAP mRNA阳性细胞数、积分光密度和△CT明显高于对照组,有显著性差异(P<0.05,P<0.01),在60d阶段,未见显著性差异;1天阶段海马组织铅含量与GFAP mRNA阳性细胞数目之间有良好的剂量反应关系,1d和21d阶段海马铅含量与GFAP mRNA积分光密度之间也有良好的剂量反应关系。综合分析海马细胞GFAP表达与学习记忆能力之间的关系,GFAP表达增强后仔鼠的学习记忆能力下降。大鼠孕期低水平铅暴露对子代大鼠海马生长相关因子的影响:免疫组化检测结果显示,各处理组1d龄的仔鼠,海马组织中GAP-43免疫组化反应物的面密度和积分光密度均显著降低,与对照组相比有显著性差异(P<0.05,P<0.01);21d阶段,中、高剂量组的面密度和积分光密度低于对照组,其差别有显著性(P<0.05,P<0.01),到60d阶段时,各剂量的面密度和积分光密度均无显著性差异;1d和21d阶段海马组织铅含量与GAP-43免疫组化面密度和积分光密度呈明显负相关。Western blot结果显示,各处理组1d和21d龄的仔鼠GAP-43蛋白表达明显低于对照组,具有显著性差异(P<0.05,P<0.01);至60d时,未见显著性差异。原位杂交结果显示,各处理组1d龄的仔鼠,GAP-43 mRNA表达的面密度、积分光密度均低于对照组,差别有显著性(P<0.05,P<0.01);21d阶段中、高剂量组的面密度和积分光密度低于对照组,差别有显著性(P<0.05,P<0.01),且和海马铅含量呈明显负相关;至60d时,各剂量组与对照组相比均无显著性差异。荧光定量PCR结果显示,各处理组1d和21d龄的仔鼠GAP-43 mRNA表达明显降低,与对照组相比具有显著性差异(P<0.01),仔鼠发育至60d时,各剂量组海马区GAP-43 mRNA表达与对照组比较未见显著性差异。免疫组化和Western blot检测仔鼠海马组织NGF的表达情况,发现各处理组1d和21d龄的仔鼠,NGF免疫组化反应物的面密度、积分光密度和相对灰度值均显著降低,与对照组相比有显著性差异(P<0.05,P<0.01),且与海马组织铅含量程明显负相关;到60d时,均未见显著性差异。原位杂交结果显示,各处理组1d龄的仔鼠,NGF mRNA阳性反应物颗粒的面密度积分光密度均低于对照组,差别有显著性(P<0.05,P<0.01);21d阶段中、高剂量组的面密度和积分光密度低于对照组,差别有显著性(P<0.05,P<0.01);1d和21d阶段海马组织铅含量与NGF mRNA面密度和积分光密度呈明显负相关;荧光定量PCR结果显示,各处理组1d和21d龄的仔鼠NGF mRNA表达显著降低,与对照组相比具有显著性差异(P<0.05,P<0.01);至60d时,未见显著性差异。综合分析GAP-43和NGF表达与仔鼠学习记忆能力的关系,发现随着海马铅含量的升高,海马组织GAP-43和NGF蛋白及mRNA表达下降,而仔鼠的学习记忆能力也随之降低。结论:大鼠孕期低水平铅暴露,可以导致仔鼠脑海马区神经细胞凋亡增加,且与海马铅含量呈正相关;可以使仔鼠脑海马区GFAP阳性的胶质细胞数目增多,GFAP蛋白和mRNA表达增加,且与海马铅含量呈正相关,GFAP表达的变化至仔鼠出生60天时消失。可以抑制仔鼠脑海马区GAP-43、NGF蛋白和mRNA表达,且这种抑制作用与海马铅含量呈正相关,蛋白和mRNA表达表达的变化至仔鼠出生60天时消失。提示大鼠孕期低水平铅暴露,可以通过诱导仔鼠海马区神经细胞凋亡、提高GFAP表达水平、降低GAP-43和NGF表达水平等机制,损伤子代的的学习记忆能力。