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外生菌根对重金属具有较高的耐受能力和吸附能力,是进行重金属生态修复的有效途径之一。许多研究发现,菌根真菌分泌热休克蛋白质能修复被重金属胁迫破坏的胞外蛋白质的三维结构和并固定胞外重金属,是其抵抗重金属胁迫的机理之一。A丛枝菌根分泌的球囊霉素是一种耐热疏水糖蛋白,也足一种分子量为60 kDa的热休克蛋白质,能与单克隆抗体Mab32b11发生特异性吸附。这种蛋白已经被证实具有较强的重金属固持能力。冈此,我们假设,作为菌根真菌的主要类型之一的外生菌根真菌,具有分泌类球囊霉素蛋白质的能力,在重金属胁迫的环境下,发挥固持重金属等抗性作用。
本论文选择外生菌根真菌红绒盖牛肝菌(Xerocomus Chrysenteron)作为被试菌种,通过研究该菌种产耐热蛋白质的特性,鉴定X.Chrysenteron是否产球囊霉素;并通过研究胞外蛋白质分泌量随时间变化的趋势,以及该蛋白对铜镉胁迫下的响应进一步研究该耐热蛋白质的特性,论证上述假设和菌丝胞外蛋白质在重金属抗性中的作用。
研究结果表明,由X.Chrysenteron在高温灭菌锅中121℃提取30 min所得的耐热蛋白质含量约为39.51μg/mg;提取所得耐热蛋白质易提取组分(easily extractableheat-resistant protein,EE-HRP)与抗体Mab32b11有特异性的免疫吸附;提取液中包含分子量为约为66 kDa的糖蛋白,该蛋白质存在于菌丝表面和培养液中,且具有明显的疏水特性。以上特性证明,外生菌根真菌X.Chrysenteron分泌的这种蛋白是球囊霉素物的同种物质。同时发现,菌丝分泌的胞外蛋白质由于溶解性不同,在菌丝表面和培养液中的分布不同;菌丝分泌到胞外的蛋白质中包含大量的糖蛋白。
分泌类球囊霉素的时序研究显示,在6周的培养过程中,随着菌丝的生长,培养液中蛋白质累积量逐渐增加,但菌丝分泌蛋白质的能力不随时间而改变。同时,菌丝分泌耐热蛋白质总提取组分(total heat-resistant protein,HRP)的能力随时间减小,菌丝表面累积的HRP总量不随时间改变。这说明HRP可能由幼嫩的菌丝在培养的早期产生到菌丝表面和体系中,随时间菌丝老化分泌能力降低。ELISA(enzyme linkedimmunosorbent assay)结果说明,具有免疫活性的类球囊霉素蛋白质在培养液中随时间积累,但是没有在菌丝表面随时间积累。还发现菌丝表面存在另一种耐热蛋白质,它在30 min热提取后保持活性,90 min提取之后失去活性,其分子量约为25 kDa(HRP25);该蛋白质存于在菌丝表面,在培养液中没有发现。并且,在对AM真菌分泌耐热蛋白质的研究中并没有文献有过相关报道。
在镉胁迫下,菌丝将体系中小于1.57％镉固定在菌丝表面和其中。菌丝固定镉的能力为0.00-0.72μg/g,其中80%的镉分布在菌丝表面。HPR固定镉能力为0.01-8.09 mg/g。这是因为镉作为有毒物质被蛋白质大量固定在细胞外和环境(培养液)中,以降低其有效性。镉诱导下,单位菌丝分泌蛋白质的能力增加,菌丝向培养液中分泌大量蛋白质可能用于固定多余的镉,并且产生了新的分子量大于40 kDa的耐热蛋白质,推测耐热蛋白质在镉解毒过程中发挥作用。
在铜胁迫下,固定体系中约5%的铜。菌丝固定铜的能力为0.15-2.30μg/g,其中50%的铜分布在菌丝表面。HRP同定铜能力为1.12-13.19 mg/g。X.Chrysenteron除了在菌丝外进行解毒,还将一部分铜运输到细胞内。铜胁迫没有增加单位菌丝向培养液中分泌蛋白质的能力,还因为菌丝生物量降低而减少了向培养体系中分泌的蛋白质的总量。但是,在菌丝生长抑制的情况下,铜诱导菌丝产耐热蛋白质。
本研究首次证明外生菌根真菌能分泌耐热蛋白质,且该蛋白质与球囊霉素相似。同时也是首次发现铜镉胁迫会诱导耐热蛋白质产生,说明热休克蛋白质可能是增加外生菌根真菌重金属抗性的重要原因。