背景和目的骨折愈合是一个复杂的细胞组织学修复过程,包括细胞增殖、分化迁移、和多种细胞因子的调控等,其中,干细胞因子(stem cell factor,SCF)与其受体c-Kit特异性结合后,诱导c-Kit二聚化或寡聚化,激活下游多条信号通路,包括PI3K-Akt-mTOR通路、ERK-MAPK通路等,对骨的形成和代谢有重要调节作用。但SCF/c-Kit受体对骨髓间充质干细胞(Bone Mesenchymal Stem Cells,BMSCs)成骨分化的影响和如何激活下游PI3K-Akt-mTOR通路和ERK-MAPK通路的机制仍未完全明确。近年来,研究证实Gαi蛋白与Gab1蛋白偶联激活酪氨酸激酶受体(Tyrosine Kinase Receptors,RTKs)下游信号通路,如:EGFR、FGFR、PDFGR等,而c-Kit受体是一种Ⅲ型RTKs受体,也可能通过Gαi蛋白介导下游信号通路。因此,本研究着重探索SCF对骨髓间充质干细胞成骨分化影响,并探讨c-Kit-Gαi/Gab1复合物介导SCF激活下游信号通路的内在机制。方法(1)取对数生长期细胞,以0、50、100ng/mL SCF处理MG63、U-2OS和BMSCs细胞48小时或者14天,用MTT法和集落形成实验检测SCF对BMSCs和成骨细胞增殖的作用。(2)以0、100ng/mL SCF和/或1μM地塞米松处理BMSCs 24小时,用流式细胞术检测SCF抗地塞米松诱导BMSCs细胞凋亡作用。(3)以Gαi-shRNA慢病毒干扰BMSCs Gαi蛋白表达后,以0、50、100ng/mLSCF或者成骨诱导剂(10-8 mol/L地塞米松、5μg/ml抗坏血酸和10mmol/Lβ磷酸甘油酸)处理BMSCs 7天,用ALP染色法和ALP活性检测试剂盒检测BMSCs成骨分化。(4)为了探索Gαi和Gab1蛋白在SCF/c-Kit信号传导中的作用,本研究以野生型小鼠成纤维细胞(Mouse embryonic fibroblasts,MEFs)和不同基因敲除型成纤维细胞为研究对象,并应用慢病毒干扰技术阻断野生型小鼠胚胎成纤维细胞和骨髓间充质干细胞Gαi蛋白表达以及用脂质体III作为载体向Gαi1/3双基因敲除型MEFs导入外源性Gαi蛋白后,用Western blot检测SCF诱导BMSCs和MEFs相关细胞Akt(Thr308和Ser473)、mTORC1、S6、GSK、Gab1、c-Kit、S6K、ERK蛋白表达及活性改变。免疫共沉淀方法检测Gαi-Gab1复合物与c-Kit受体偶联情况。结果(1)SCF促进MG63、U-2OS成骨细胞和BMSCs体外增殖和克隆形成(p<0.05)。(2)SCF抑制地塞米松诱导BMSCs凋亡作用(p<0.05)。(3)ALP染色及活性检测结果显示,与对照组相比,SCF增加了ALP阳性细胞数量和ALP活性(p<0.05),而Gαi-shRNA干扰BMSCs后,ALP阳性细胞数量和ALP活性无明显增加(p>0.05)。(4)Western Blot结果显示,c-Kit受体表达于MG63、U-2OS成骨细胞和BMSCs,并被SCF激活。SCF诱导BMSCs和MEFs Akt-mTORC1和ERK-MAPK信号通路相关分子Akt(Thr308和Ser473)、mTORC1、S6、GSK、Gab1、S6K、ERK蛋白以及c-Kit受体磷酸化,而基因敲除或者shRNA干扰技术阻断Gαi1、Gαi3或Gab1蛋白表达后,SCF不能诱导BMSCs和MEFsAkt(Thr308和Ser473)、mTORC1、S6、GSK、Gab1、S6K、ERK蛋白以及c-Kit受体磷酸化。外源性导入Gαi1或Gαi3蛋白到Gαi1/3双基因敲除型MEFs(DKO)细胞后,SCF能诱导MEFsAkt(Thr308和Ser473)、mTORC1、S6、GSK、Gab1、S6K、ERK蛋白以及c-Kit受体磷酸化。免疫共沉淀结果显示在BMSCs和MEFs中,Gαi/Gab1复合物均能与c-Kit受体发生偶联。结论SCF促进成骨细胞和骨髓间充质干细胞存活和克隆形成能力,抑制地塞米松诱导骨髓间充质干细胞凋亡。Gαi-Gab1与c-Kit受体偶联介导SCF激活Akt-mTORC1和ERK-MAPK信号通路。本研究结果为研究SCF促进成骨细胞分化的机制提供了新的研究思路,有待更进一步研究。