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研究背景与目的：肿瘤干细胞学说认为肿瘤中存在一群数量极少，具有自我更新和分化能力的肿瘤细胞，即肿瘤干细胞（Cancer stem cell，CSC）。目前研究发现，肿瘤干细胞是维持肿瘤生长、转移和复发的根源，消灭肿瘤干细胞可能成为治愈肿瘤、防止复发的新方向。同时,研究发现一些mircoRNA（miRNA）的异常表达导致了肿瘤的发生、发展，并广泛参与了肿瘤细胞的增殖、分化、凋亡、侵袭和转移的调节。本实验旨在探讨通过非粘附球培养法从肝癌细胞系中富集肝癌干细胞，利用基因芯片技术筛查肿瘤细胞和肿瘤干细胞的miRNA表达谱，分析两者表达谱的差异，为进一步探讨miRNA在肝癌干细胞分化中的作用和调控机制提供新的线索。方法：1、应用非粘附球培养法从肝癌细胞系中富集到肝癌干细胞样细胞球，并进行体外扩增。利用肿瘤干细胞的一些特性对富集到的肝癌干细胞样细胞球进行鉴定。2、将通过鉴定的肝癌干细胞提取总RNA。利用紫外分光光度计和琼脂糖凝胶电泳技术对提取的RNA进行质量检测。对符芯片要求的RNA进行荧光标记再与Exiqon miRNA基因表达谱芯片进行杂交。然后用扫描得到的芯片结果进行miRNA表达差异分析。结果：1、利用非粘附球培养法可以在Hep3B、 HepG2、 Huh7细胞系中富集得到悬浮成球生长的细胞球且都能持续传代。且单细胞成球实验证实悬浮细胞球是由单个细胞增殖形成，不是多个细胞聚集。2、富集得到的Huh7悬浮细胞球细胞体外形成的集落数是Huh7细胞二倍。说明细胞球细胞体外集落形成能力较Huh7细胞强。3、Huh7细胞被甲苯胺蓝染成蓝紫色，而Huh7悬浮细胞球细胞不能被染色，说明干细胞培养条件下的肿瘤细胞球的细胞通透性降低。4、流式检测Huh7悬浮细胞球细胞的干细胞标志分子CD326为93%，肿瘤细胞的CD326为0.2%，表明在Huh7悬浮细胞球细胞的干细胞特异性分子表达明显上调。5、裸鼠成瘤实验显示5000个Huh7悬浮细胞球细胞细胞就能使裸鼠成瘤，而huh7最少需要10万个才能成瘤。说明Huh7悬浮细胞球细胞的成瘤性远远大于普通肿瘤细胞。6、分别取Huh7细胞和第3代的Huh7悬浮细胞球细胞用Trizol法提取总RNA，并用紫外分光光度计测得OD280/260值分别为2.04；2.07。琼脂糖电泳得到的28s、18srRNA条带明亮清晰，亮度比值约为2:1，miRNA完整性好符合芯片检测要求。7、利用Hy3TM对样本RNA进行标记后跟miRNA芯片进行杂交，用Genepix4000B对图像进行扫描分析，把图像信号用Genepix Pro6.0软件转化成数字信息并进行数据分析。从结果中可以看出miRNA在肝癌细胞和肝癌干细胞中的表达有显著差异。8、miRNA芯片分析：共获得383个差异表达的miRNAs，其中110个表达上调，273个表达下调，部分表达差异明显的miRNAs可能与调控肝癌干细胞分化密切相关。结论：通过非粘附球培养富集法能从Huh7肝癌细胞系中得到肝癌干细胞。miRNA基因芯片结果显示相较于肝癌细胞部分miRNA在肝癌干细胞中表达上调，部分miRNA在肝癌干细胞中表达下调。为进一步探讨miRNA在肝癌干细胞分化中的作用和调控机制提供新的线索。