卵巢癌是死亡率最高的妇科恶性肿瘤之一,在治疗难题中的主要原因是化疗药物的耐药及化疗药物所带来的全身毒副作用,限制了患者的依从性,降低了患者的生活质量,甚至导致化疗的失败。因此,寻找新的、具有协同作用的化疗药物越来越引起人们的关注。三氧化二砷(arsenictrioxide, AS2O3)是中药复方青黛、砒霜等的主要有效成分。AS203通过降解早幼粒细胞白血病基因PML和维甲酸受体α基因RARα融合所表达的PML-RARα融合蛋白,调节谷胱甘肽还原系统、发挥细胞周期抑制和促凋亡等多种途径发挥抗肿瘤作用。目前,AS203已经应用于白血病的临床治疗,主要用于治疗复发及难治性急性早幼粒细胞白血病APL。维甲酸类化合物(retinoids,即维生素A衍生物之称)通过激活相应的受体,识别靶基因的应答部位,以蛋白质-核酸的结合形式调控特定基因的转录活性,发挥细胞增殖、分化和凋亡等多种生物学效应。天然的全反式维甲酸(all-trans retinoic acid, ATRA)是生物学活性最强的维生素A的衍生物,已广泛应用于临床皮肤癌的治疗。ATRA的抗肿瘤作用的证实被誉为九十年代国际抗癌药物的三大发现之一,具有很强的诱导分化肿瘤细胞作用,已成为治疗APL的一线药物。近年来,细胞周期及其相关的周期调节蛋白已成为肿瘤发病机制及化疗药物研发的热点,在细胞周期的进程中存在多个调控点,其中G1/S和G2/M调控点最为重要,细胞增殖除受到细胞周期的几个调控点作用外,还受到细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂(cycle dependent kinases inhibitors, CKIs)的调控,常见的如P27和P16。P27蛋白通过抑制细胞周期蛋白的活性和细胞周期蛋白激酶(cycle dependent kinases, CDKs)的激活,发挥抑制细胞周期进程的作用。因此,细胞周期蛋白的异常表达和CKIs的缺失将使细胞周期发生紊乱,导致细胞增殖失控。关于细胞周期调节因子异常与肿瘤发病机制之间的研究多集中于G1/S期,对G2/M期调节的研究较少,因此,对细胞周期G2/M期调控机制的研究,有助于我们更好地了解肿瘤的发病机制及合理的应用化疗药物。关于卵巢癌的临床治疗,目前仍多采用以顺铂为基础的两种或多种化疗药物的联合应用,药物之间的关系多为单纯性的相加作用,即化疗作用相加的同时全身的毒副作用也是相加的,能否通过寻找具有协同作用的两种药物,发挥治疗作用的同时,毒副作用不会增加,甚至降低,从而提高卵巢癌患者的生活质量,一直是我们关心的热点。目的本实验采用ATRA不敏感型、人浆液性上皮性卵巢癌细胞株SKOV3细胞为实验对象,拟通过AS203及ATRA单独或联合用药,观察不同药物组对SKOV3细胞的抑制、杀伤与促凋亡效应的影响,探讨两种药物间的相互作用及与细胞周期负性调控蛋白P27之间可能的关系,为卵巢癌的化疗提供新的思路及理论依据。方法以ATRA不敏感型、人浆液性上皮性卵巢癌细胞株SKOV3细胞为实验对象,实验分为：正常对照组(含10%小牛血清的1640培养液)、ATRA组(1.0μmol/L ATRA)、AS2O3组(5.0μmol/L AS2O3)和联合组(1.0μmol/L ATRA和5.0 u mol/L AS2O3),分别按分组培养的所需时间取样。四甲基偶氮唑蓝光吸收法MTT,检测不同组处理24-96h对人卵巢癌SKOV3细胞的增殖的影响；采用流式细胞术,观察不同药物组作用48h对人卵巢癌SKOV3细胞周期阻滞、凋亡及坏死情况的影响；通过免疫荧光法检测不同药物组、不同时间点,人卵巢癌SKOV3细胞中细胞周期负性调控蛋白P27的表达情况。本实验采用SPSS13.0统计软件进行数据处理,检验水准为α=0.05。结果1 AS2O3、ATRA单独或联合用药对人卵巢癌SKOV3细胞增殖的影响四甲基偶氮唑蓝光吸收法结果显示：ATRA组中SKOV3细胞的生长抑制状况,与对照组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。AS2O3组和联合组中,细胞生长受抑制,与对照组相比,差异均有统计学意义(P<0.05)。联合组与AS2O3组相比,细胞生长受抑制,差异有统计学意义(P<0.05)。2 AS2O3、ATRA单独或联合用药48h对人卵巢癌SKOV3细胞周期、凋亡率及坏死率的影响流式细胞术证实：SKOV3经不同药物组处理后,细胞周期阻滞不同,以48h最显著。AS203组和联合组均出现G0/G1期和G2/M双重阻滞,,与对照组比较,差异均有统计学意义（P<0.01)。联合组与AS203组相比,G2/M期阻滞更明显,差异有统计学意义(P<0.01)。Annexin V/PI染色检测凋亡,AS203组和联合组中,细胞凋亡率和坏死率均增强,与对照组相比,差异均有统计学意义(P<0.01)。联合组与AS203组相比,凋亡率明显增加,差异有统计学意义(P<0.01),坏死率无增加,反而降低,差异有统计学意义(P<0.05)。3 AS2O3、ATRA单独或联合用药对人卵巢癌SKOV3细胞中P27蛋白表达的影响细胞免疫荧光化学法显示：不同药物组SKOV3细胞中P27蛋白的表达不同,AS203组和联合组中P27蛋白的表达有时间依赖性,48h表达最强,96h仍然维持在较高水平,与对照组相比,差异均有统计学意义(P<0.01)；联合组中P27蛋白表达量更为明显,与AS203组相比,差异有统计学意义差异(P<0.01)。结论(1)AS203上调人卵巢癌SKOV3细胞中P27蛋白的表达,提高SKOV3细胞对ATRA药物的敏感性。(2)AS203和ATRA联合应用发挥协同抑制作用,出现细胞周期G0/G1期和G2/M期双重阻滞现象,凋亡率增加,坏死率降低,为卵巢癌新药的研发及化疗方案的合理应用提供理论依据。