第一部分 缺血再灌注肝损伤中巨噬细胞中PTEN-β-Catenin信号轴与T细胞分化的关系目的:为了更深入的研究肝脏切除及肝脏移植术中缺血再灌注诱导的肝损伤的发病机制,我们采用小鼠70%肝脏缺血再灌注损伤模型来模拟上述环境,进一步探讨先天与后天免疫在缺血再灌注诱导肝损伤过程中的机制,此次研究一方面是建立稳定的小鼠缺血再灌注肝损伤模型,其次是探索巨噬细胞中PTEN-β-Catenin信号轴与T细胞分化的关系,进一步明确先天及后天免疫在缺血再灌注肝损伤过程中的机制。方法:本实验利用常规造模方法,将实验动物分为4组。A组为假手术组（sham+PTENFL/FL组）;B 组为假手术组（sham+PTENM-KO 组）;C 组造模组（IR+PTENFF/FL组）;D组造模组（IR+PTENM-KO组）。收集肝脏组织行H/E染色检测;肝功能检测;部分组肝组织行Suzuki’s评分,测定肝组织坏死情况;测定CD68+巨噬细胞细胞侵润情况;灌注并分离收集肝脏巨噬细胞,Western-blot测定β-Catenin及AKT蛋白表达情况;RT-PCR测定肝脏组织炎症因子TNF-a,IL-6,IL-1β,TGF-β及Foxp3,IL-17A,RORγt的表达情况。体外实验:给予BMMs 转染β-catenin si RNA,进一步测定 β-Catenin,PPARγ,NICD 蛋白表达情况,并进一步测定炎症因子的分泌情况;进一步在共培养体系中测定T细胞的Foxp3,IL-17A,RORγt 的表达情况。进一步,给予 BMMs 转染 PPARγ si RNA,进一步测定巨噬细胞中PPARγ,T细胞中NICD蛋白表达情况,并进一步测定炎症因子的分泌情况;进一步在共培养体系中测定T细胞的Foxp3,IL-17A,RORγt的表达情况。给予BMMs转染Jagged-1 si RNA,进一步测定T细胞中NICD蛋白表达情况,进一步在共培养体系中测定T细胞的Foxp3,IL-17A,RORγt的表达情况。最后体内实验:尾静脉注射Notch抑制剂DAPT,收集肝脏组织行H/E染色切片;肝功能检测;部分组肝组织行Suzuki’s评分,测定肝组织坏死损伤情况;测定蛋白Hes1的表达情况;流式测定TH17及Treg细胞的侵润情况。结果:缺血再灌注诱导后,C、D组模型与A组和B组比较也出现不同程度的肝脏损害,C组损害的程度较D组重。同上述病理改变,C、D组模型与A组和B组比较也出现不同程度的肝功能损害,C组损害的程度较D组重。C、D组模型可见明显的肝细胞坏死,C组明显高于D组。C组的CD68+巨噬细胞侵润数目亦明显高于D组。骨髓源细胞特异性PTEN基因敲除,促进了β-catenin及p-AKT蛋白的表达;抑制了 TNF-a,IL-6,IL-1β基因表达,同时促进了 TGF-β的表达。同时在缺血再灌注肝组织中,骨髓源细胞特异性PTEN基因敲除促进了单核-巨噬细胞向M2型的分化,抑制了向M1型的转变,减少炎症反应。在缺血再灌注肝组织中,PTEN基因敲除促进了 Foxp3基因表达,同时抑制了IL-17A,RORγt的基因表达。同时测定脾脏组织,PTEN基因敲除促进了 Foxp3基因表达,同时抑制了 IL-17A,RORγt的基因表达。体外实验:LPS刺激骨髓分化巨噬细胞BMMs,PTEN基因敲除,促进了β-catenin、PPARγ及Jagged-1蛋白的表达,并抑制了 TNF-a,IL-6,IL-1β基因表达,同时促进了 TGF-β的表达;转染β-catenin si RNA,LPS刺激后,western-blot检测显示,其抑制了 PPARγ及Jagged-1蛋白的表达;进一步共培养体系中:PTEN基因敲除促进了 T细胞中Notch蛋白的表达,同时促进了 Notch信号的Notch1,Hes1及RBP-J基因表达;进一步促进了 Foxp3基因表达,同时抑制了 IL-17A,RORγt的基因表达。转染β-catenin si RNA后的共培养T细胞中,上述结果测定相反。体外实验:LPS刺激骨髓分化巨噬细胞BMMs,转染PPARγ si RNA后,抑制了 PTEN基因敲除所导致的PPARγ及Jagged-1蛋白的高表达;共培养体系中:抑制PPARγ后,阻碍了 PTEN基因敲除所导致的T细胞中Notch蛋白的高表达、Foxp3基因的高表达及IL-17A,RORγt的基因低表达。体外实验:LPS刺激骨髓分化巨噬细胞BMMs,转染Jagged-1 si RNA后,抑制了 PTEN基因敲除所导致的Jagged-1蛋白的高表达;共培养体系中:抑制Jagged-1后,逆转了 PTEN基因敲除所导致的T细胞中NICD蛋白的高表达、Foxp3基因的高表达及IL-17A,RORγt的基因低表达。体内实验,尾静脉注射DAPT后,逆转了 PTEN基因敲除对肝组织的保护作用,加重了肝损伤程度,升高了 ALT指标,促进了肝细胞的凋亡,抑制Hes1蛋白的表达,抑制Foxp3基因的表达,相反促进了 IL-17A,RORγt基因的表达。流式细胞分析显示:尾静脉注射DAPT后,促进了初始T细胞向CD4+RORγt+TH17细胞的分化,相反抑制了初始T细胞向CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞的分化,减少了 Treg细胞的保护,加重了肝损伤。结论:在缺血再灌注肝诱导的损伤模型中,骨髓源细胞特异性PTEN基因敲除保护了缺血再灌注诱导的肝组织损伤。其机制可能是巨噬细胞PTEN基因的敲除,通过促进β-catenin的蛋白表达,进一步促进PPARγ蛋白的表达,最终促进巨噬细胞表面Notch特异性配体Jagged-1的表达,从而激活T细胞Notch受体,在泡内γ分泌酶剪切下,促进NICD生存,并向核内转录,激活Foxp3等目的基因,促进初始T细胞向CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞分化,同时抑制其向CD4+RORγt+TH17的分化,减少了炎症反应。第二部分 缺血再灌注诱导肝损伤中,巨噬细胞ATF3-mTOR信号轴与T细胞分化的关系目的:激活转录因子3（ATF3）,一种压力诱导的转录因子,在调节免疫及代谢稳态方面启着重要作用。mTOR及缺氧诱导因子（HIF）的激活在调节免疫细胞功能方面亦有着关键作用。本次研究目的是为了探讨在缺血再灌注肝损伤过程中,ATF3与mTOR/HIF信号轴调节免疫反应的关系。方法:首先:常规造模,试验分为四组,假手术组A:sham+ATF3（WT）组;假手术组B:sham+ATF3（KO）组;手术组C:IR+ATF3（WT）组;手术组D:IR+ATF3（KO）组。收集获得肝脏组织,行HE染色测定肝组织损伤情况,并行损伤评分;收集血液行肝功能检测;肝组织行MPO、TUNEL检测;并测定凋亡与抗凋亡蛋白表达情况。免疫组化:肝组织测定侵润巨噬细胞,中性粒细胞情况;RT-PCR测定炎症因子:TNF-a,IL-1β,IL-6,TGF-β的表达情况;测定mTOR,HIF-1α,p70S6K,TLR4,PHD1等蛋白表达情况;流式测定FOXP3+Treg细胞与RORγt+TH17细胞的比例。ELISA测定血清IL-17A分泌情况。体内给予mTOR靶向抑制剂雷帕霉素。收集标本行HE染色测定肝组织损伤情况,并行损伤评分;收集血液行肝功能检测;肝组织行TUNEL检测;免疫组化:肝组织测定侵润巨噬细胞,中性粒细胞情况;RT-PCR测定炎症因子:TNF-a,IL-1β,IL-6,TGF-β的表达情况;western-blot 测定 mTOR,HIF-1α,p70S6K,TLR4,PHD1等蛋白表达情况。体外试验:体外给予BMMs给予雷帕霉素。LPS刺激后western-blot测定mTOR,HIF-1α,p70S6K,TLR4,PHD1等蛋白表达情况。RT-PCR测定炎症因子:TNF-a,IL-1β,IL-6,TGF-β的表达情况;BMMs与T细胞共培养:LPS刺激后,RT-PCR测定FOXP3,RORγT,IL-17A的表达情况;ELISA测定血清IL-17A分泌情况。体外试验:体外给予BMMs给予小RNA（si p70S6K）。LPS刺激后western-blot测定HIF-1α,p70S6K,TLR4,PHD1等蛋白表达情况。RT-PCR测定炎症因子:TNF-a,IL-1β,IL-6,TGF-β的表达情况;BMMs与T细胞共培养:LPS刺激后,RT-PCR测定FOXP3,RORγt,IL-17A的表达情况;ELISA测定血清IL-17A分泌情况。体内试验:给予巨噬细胞特异性转染小RNA（si HIF-1a）。收集标本行HE染色测定肝组织损伤情况,并行损伤评分;收集血液行肝功能检测;肝组织行TUNEL检测;RT-PCR测定炎症因子:TGF-β的表达情况;流式测定TH17细胞的比例。ELISA测定血清IL-17A分泌情况;RT-PCR测定FOXP3,RORγt,IL-17A的表达情况。结果:ATF3敲除明显加重了缺血再灌注诱导的肝损伤。HE染色可见D组较C组明显加重;损伤评分:D组较C组明显加重;肝功能检测:D组较C组明显升高;中性粒细胞侵润指标MPO:D组较C组明显升高;肝细胞凋亡TUNEL检测:D组较C组明显加重;ATF3敲除抑制了抗凋亡蛋白的表达相反增加了凋亡蛋白的表达。ATF3敲除促进了巨噬细胞,中性粒细胞侵润。ATF3敲除促进了炎症因子TNF-a,IL-1β,IL-6的表达相反减少了 TGF-β的表达。ATF3敲除促进了 mTOR,S6K,TLR4蛋白的表达,同时抑制PHD1的表达相反促进HIF-1a的表达。ATF3敲除减少了 FOXP3+Treg的比例增加了 TH17细胞的比例;同上述数据一致:血清可见增多的IL-17A表达水平。给予雷帕霉素,明显改善了缺血再灌注诱导的肝损伤。从肝损伤程度,TUNEL检测,肝功能检测可以得出雷帕霉素减少了 ATF3敲除所导致的肝损伤。进一步:雷帕霉素减少了巨噬细胞,中性粒细胞侵润;同时逆转了 ATF3敲除所导致的mTOR,S6K,TLR4,HIF-1a蛋白的高表达,PHD1的低表达。改善了炎症反应。体外给予给予雷帕霉素。LPS刺激后,雷帕霉素明显逆转了 ATF3敲除所导致的mTOR,S6K,TLR4,HIF-1a蛋白的高表达,PHD1的低表达,逆转了 ATF3敲除所导致的TNF-a,IL-1β,IL-6的高表达同时TGF-β的低表达,逆转了 mRNA FOXP3的低表达,RORγT与IL-17A的高表达,同时也逆转了蛋白水平IL-17A的高表达。体外给予给予转染小RNA（si S6K）。LPS刺激后,抑制si S6K明显逆转了ATF3敲除所导致的S6K,TLR4,HIF-1a蛋白的高表达,PHD1的低表达,逆转了 ATF3敲除所导致的TNF-a,IL-1β,IL-6的高表达同时TGF-β的低表达,逆转了 mRNAFOXP3的低表达,RORγt,IL-17A的高表达,同时也逆转了蛋白水平IL-17A的高表达。体内试验:给予巨噬细胞特异性转染小RNA（si HIF-1a）。HE染色可见抑制HIF-1a逆转了ATF3敲除所导致的肝损伤,肝细胞凋亡及肝功能升高;抑制HIF-1a提升了TGF-β的表达;减少了 TH17细胞的比例,同时减少了 IL-17A的表达。结论:在缺血再灌注肝损伤过程中,ATF3/mTOR信号轴参与了免疫调节反应,其可能通过HIF-1a影响TGF-β介导的FOXP3+Treg/TH17比例的变化有关。