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目的:1.研究人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)感染与食管癌(esophageal carcinoma,EC)发生的相关性:检测我国不同区域EC患者癌组织中HPV感染率及其型别,了解我国不同区域EC组织中HPV型别分布特性;检测HPV16 E2/E6基因比率,分析EC样品中HPV16的整合状态;检测HPV整合在染色体的位置,以及通过对我国已发表的有关HPV与EC相关文献的Meta分析,探讨HPV感染与我国EC发生的病因学关系。2.研究EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)感染与胃癌发生的相关性:通过对PubMed数据库中的有关EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)与胃癌相关文献的Meta分析,探讨EBV感染与胃癌发生的相关性;构建携带EBV编码BARF1基因的真核表达载体,为今后建立EBV感染体外模型奠定基础,以便进一步探讨EBV感染与胃癌发生的病因学关系。方法:1.应用HPV L1基因区通用引物PGMY09/11和GP5+/6+,进行巢式聚合酶链反应(nested polymerase chain reaction,NPCR);应用HPV(包括HPV16、HPV18)E6-E7基因保守区的简并引物,及HPV16 E6、HPV18 E6型特异引物进行巢式多重聚合酶链反应(nested multiplex Polymerase chain reaction,NMPCR),检测EC组织中HPV16和HPV18两型别;分析我国不同区域EC标本中HPV感染状况。2.应用HPV16 E2和E6引物进行实时荧光PCR扩增,检测HPV16 E2与E6的含量,通过E2与E6的比率,确定HPV整合状态;用β-actin引物进行荧光PCR扩增,检测每一样品中β-actin含量,通过HPV16E6与β-actin之比,估算HPV16的病毒载量。3. Oligo(dT)17-P3引物反转录PCR扩增cDNA的第一链,HPV E7特异P1 forward与P3 reverse引物第一轮扩增,HPV E7特异P2 forward与Oligo(dT)17-P3 reverse引物第二轮扩增,将第二轮产物连接到pMD-18T载体,进行测序分析,分析HPV整合在人染色体的位置。4.确定文献选择与剔除标准后,以HPV和食管癌为关键词,在国内万方网和中国知网,检索有关HPV与食管癌相关的研究论文,依据Cochrane系统,按照Mantel–Haenszel方法,对文献数据作出异质性检验,应用随即效应模型,计算各项研究文献中食管癌病例组和正常对照组中HPV的优势比(odds ratio,OR)、权重(weight)、95%可信区间(95%CI)及合并后的权重和95%CI。数据处理采用Review Manager 4.2软件完成,以P<0.05为差异有显著性。进一步验证HPV在我国食管癌发生中的病原学作用。5.确定文献选择与剔除标准后,以EBV和胃癌为关键词,在PubMed数据库中,检索有关EBV与胃癌相关的研究论文,依据Cochrane系统,按照Mantel–Haenszel方法,对文献数据作出异质性检验,应用随机效应模型,计算各项研究文献中EBV相关胃癌与临床病理特征的优势比(odds ratio,OR)、权重(weight)、95%可信区间(95%CI)及合并后的权重和95%CI。数据处理采用Review Manager 4.2软件完成,以P<0.05为差异有显著性。进一步验证EBV在胃癌发生中的病原学作用。6.根据GenBank提供的cDNA序列,设计特异性引物,构建BARF1基因的真核表达载体。结果:1.从收集的食管癌患者标本中检测HPV感染的阳性率:河南省林州市为93.2% (109/117);河北保定市为88.1%(37/42);四川省盐亭市为95%(19/20)。它们主要以HPV16型出现,其次是HPV18型:HPV16型阳性率分别占59.6%(65/109)、51.4%(19/37)和57.9%(11/19);HPV18型分别占阳性率的19.3%(21/109)、21.6%(8/37)和21.1%(4/19)。2.荧光PCR结果显示:32例HPV16E6阳性标本中,检测到6.3%(2/32)为纯游离型、84.3%(27/32)为游离/整合的混合型、9.4%(3/32)为完全整合型,说明病毒DNA与宿主基因组整合很普遍;这些标本的病毒载量大约在0.066-65.2拷贝/细胞之间。3.序列分析结果显示,有两位HPV18阳性的食管癌患者,其HPV18整合于患者5号染色体上。4.入选17篇文献食管癌组织标本HPV检出率为44.0%,正常对照组织HPV检出率为16.7%,食管癌组织中HPV感染率与正常对照组织相比具有统计学意义(P<0.05);有12篇文献进行了HPV16型特异性检测,其结果显示,食管癌组织标本中HPV16占38.6%,正常组织标本中HPV16占15.9%,HPV16感染率与正常对照组织相比具有显著性差异(P<0.05)。被检标本分布在河南、广东、新疆、四川、河北、上海、福建和香港八个区域,其HPV感染与地域分布存在显著性差异(P<0.05)。5. 22篇入选文献中收集的胃癌病例5475例,检测到EBV阳性病例411例。在EBV阳性胃癌中,男性检出率为11.1%,女性检出率为3.0%;EBV阳性胃癌与阴性胃癌相比具有较少的淋巴结转移;残胃癌中EBV感染率为28.3%;EBV感染与组织学分型及标本类型无显著相关性(p>0.05)。6.以两端添加酶切位点的特异性引物,进行PCR扩增,得到与预期目的基因片段大小相符的666bp的片段;克隆至载体后,经双酶切和测序分析,确认BARF1基因已正确连接到pcDNA3.1(+)-his真核表达载体。结论:1.河南省林州市、河北省保定市及四川省盐亭市食管癌样品中,HPV检出率分别为93.2%、88.1%和95.0%,平均阳性率为92.2%;其中,HPV16和HPV18两型别平均检出率分别为53.1%和18.4%,说明HPV16和HPV18两型别在我国具有较高的分布频率。提示HPV16和HPV18两型别可能在食管癌发生中具有普遍意义。2. HPV16阳性食管癌样品中,病毒DNA与宿主基因整合很普遍,提示HPV感染可能是食管癌发生的重要病原因子。3.部分HPV18可能整合在人5号染色体,推测HPV基因组在宿主细胞染色体上整合后,形成HPV持续性感染,是细胞转化及癌变的关键。4. Meta分析显示,我国食管癌组织中HPV感染与正常组织相比具有显著性差异(p<0.05),并且高危型HPV感染在不同地域普遍存在。这些结果进一步证实高危型HPV感染是食管癌发生的重要病原因子。5. EBV感染仅发生在癌组织细胞中,并且与患者性别、淋巴结转移、癌组织发生部位显著相关(p<0.05),与患者癌组织学分型、标本类型无显著相关性(p>0.05);提示,EBV阳性胃癌具有独特的临床病理学特征,EBV感染与部分胃癌的发生密切相关。6.成功地构建了真核表达载体pcDNA3.1(+)/BARF1-his,为今后建立EBV相关胃癌研究的体外模型奠定了基础。