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背景:Asahara等首次从人外周血中分离得到可以在体外增殖、分化为成熟内皮细胞的特殊细胞群,将其命名为内皮祖细胞(Endothelial progenitor cells, EPCs),并利用小鼠模型证明了骨髓源性的EPCs参与了出生后的血管形成。随后,EPCs成为国内外研究的热点,大量研究表明,EPCs能特异性归巢至肿瘤细胞增生活跃的“热点”部位,并在肿瘤的发生和发展过程中起重要作用。基于此,许多学者认为有望通过移植标记的EPCs、采用磁共振成像(Magnetic resonance imaging, MRI)技术来检测肿瘤的浸润或卫星病灶,从而提高临床诊治水平。但EPCs的主要作用是归巢并整合到肿瘤生长区域的新生血管中,外源性的EPCs是否会促进活体肿瘤细胞的增殖和发展,这是一个值得担心的问题,也是EPCs作为MRI靶向造影剂急需解决的前提。本实验将研究体外和活体条件下EPCs对胶质瘤细胞和胶质瘤生物学行为的影响,评价EPCs作为MRI造影剂载体的可行性和安全性,为细胞水平靶向造影剂的研究提供实验基础。目的:探讨大鼠脾脏来源内皮祖细胞在体外非接触式共培养环境下对C6胶质瘤细胞增殖、侵袭等生物学行为的影响;并以MRI观察SPIO标记的内皮祖细胞对胶质瘤生长的影响,同时观测不同时间点胶质瘤血流变化的MR灌注差异,与病理学相关指标对照,明确EPCs对肿瘤生长、微血管形态和密度改变以及肿瘤VEGF表达的影响,为磁性标记的EPCs作为MRI靶向造影剂在胶质瘤诊断中的的应用提供可行性和安全性实验依据。材料和方法:1.体外EPCs对C6胶质瘤细胞增殖和侵袭能力的影响取清洁级健康SD大鼠脾脏,采用密度梯度离心法获取单个核细胞,培养3天后首次换液并用DPBS洗去非贴壁细胞,继续培养至第7天,以后每隔3天更换培养基。多波长激光共聚焦显微镜鉴定DiI-acLDL和FITC-UEA-1双染色阳性细胞为正在分化的EPCs,免疫荧光检测其表面标志物CD34和CD31进一步鉴定EPCs。当EPCs长满约60%～70%时换液,离心后收集上清。换上新鲜的培养基继续培养一段时间后换液并收集之,将收集的同一批EPCs的培养上清液混匀并过滤得到内皮祖细胞条件培养基(Endothelial progenitor cells conditional medium,EPCs-CM)。按照0～50% 6个浓度的EPCs-CM与C6胶质瘤细胞的常规培养基混合,将C6胶质瘤细胞的培养分为六组,37℃,5% CO2孵育36和48h后MTT法检测光密度值反映各组C6胶质瘤细胞的增殖活力。分别采用按1:1混合的EPCs-CM与C6胶质瘤细胞常规培养基和单纯常规培养基体外培养C6胶质瘤细胞24h,流式细胞仪检测两组C6胶质瘤的细胞周期分布从而比较两组细胞的增殖率。采用Matrigel形成人工基底膜,应用改良的Boyden小室构建C6胶质瘤细胞的侵袭模型,实验组的上室加入EPCs-CM制悬的C6胶质瘤细胞悬液,对照组则加入等体积的DMEM/F12完全培养基制悬的C6胶质瘤细胞悬液,相同条件下孵育一定时间后检测两组C6胶质瘤细胞侵袭能力的差别。同时,采用细胞-基质粘附实验检测EPCs对C6胶质瘤细胞侵袭能力的影响。2.磁性标记的EPCs对C6胶质瘤细胞增殖和侵袭能力影响的在体MRI研究利用立体定位仪原位移植C6胶质瘤细胞,建立SD大鼠脑胶质瘤模型。对照组只移植C6胶质瘤细胞,实验A组移植50%细胞悬液体积的EPCs-CM和C6胶质瘤细胞,实验B组移植按1:1混合的C6胶质瘤细胞和P7228标记的EPCs,实验C组待大鼠成瘤后从尾静脉移植与实验B组等量的P7228标记的EPCs。各组采用自旋回波序列(SE),梯度回波序列(GRE)行MRI常规扫描,观察各组模型在接种后3d、7 d、10 d、15 d、20 d和25 d 6个时间点的肿瘤生长情况,于肿瘤增强图像上测量4组模型大鼠脑胶质瘤的最大左右径、最大前后径和最大上下径,依据肿瘤体积=最大前后径×最大左右径×最大上下径公式计算得到其生长体积,反映各组模型颅内胶质瘤的生长情况。同时,采用平面回波成像(EPI)行PWI扫描,经图像处理后得到各组模型大鼠脑胶质瘤的CBV和MTT图,从而评估肿瘤的血流变化以反映肿瘤新生血管的形成差异。实验C组在移植P7228标记的EPCs后第1d、3d、5d、7d和9d进行MR扫描,观察EPCs不同扫描时间点在肿瘤组织中聚集部位的变化。各组在每个时间点采用4%多聚甲醛心脏灌注后,取得脑组织标本进行病理切片分析。病理切片HE染色观察肿瘤的一般形态,普鲁士蓝染色观察P7228标记的EPCs在肿瘤组织中的分布,应用免疫组化技术进行CD34肿瘤微血管染色和VEGF染色,以计算机图像分析软件定量分析各组胶质瘤模型微血管密度、形态和肿瘤VEGF表达。结果:1.体外EPCs对C6胶质瘤细胞增殖和侵袭能力的影响单个核细胞接种24h后,已有部分细胞贴壁,细胞呈小圆形,培养3天后贴壁的细胞开始变大、透亮度增强并出现梭形细胞。第7天,细胞增殖加快、数量增多、出现较多的梭形细胞和细胞首尾相连形成的“直线”样结构。至第14天,见细胞呈“铺路石”样排列。培养一周,多波长激光共聚焦显微镜鉴定DiI-acLDL和FITC-UEA-1双染色阳性细胞为正在分化的EPCs,双染色阳性细胞百分率大于90%;免疫荧光检测EPCs一致性表达CD34和CD31。随着EPCs-CM含量的增加,体外孵育36h和48h两个检测时间点各组的光密度值也随之增加, 50% EPCs-CM组光密度值(2.018±0.220)、(2.388±0.448)均高于对照组(1.163±0.103)、(1.106±0.174),且差别具有显著统计学意义(P<0.01)。流式细胞仪检测结果表明,EPCs-CM培养的C6胶质瘤细胞的增殖率即S+G2/M明显高于对照组的增殖率(P<0.05)。体外重组基底膜实验显示实验组的C6胶质瘤细胞,即用EPCs-CM培养的C6胶质瘤细胞穿过人工基底膜的数量(MTT法表示为光密度值,3.881±0.159)大于对照组单纯用常规培养基培养的C6胶质瘤细胞(3.532±0.116, P<0.05)。EPCs-CM组的C6胶质瘤细胞在37℃,5% CO2环境中孵育2h后,其粘附在人工基底膜的细胞数量高于单纯用同体积常规培养基培养的C6胶质瘤细胞(P<0.05)。2.磁性标记的EPCs对C6胶质瘤生长和侵袭能力影响的在体MRI研究模型建立后10d左右,4组模型大鼠可见右侧脑实质内肿瘤形成,T2WI为高信号,增强扫描明显强化,15～20d肿瘤体积增长迅速呈近指数生长,4组模型大鼠颅内肿瘤的瘤体随着瘤龄的增长而增大,且4个检测时间点(10d、15d、20d和25d)之间比较差异具有显著统计学意义(P<0.01)。虽然实验C组第10d和25d的生长体积(46.714±7.325,646.171±37.600mm3)较其余3组稍大,但各组间差异无统计学意义(P>0.05)。实验B组因聚集在接种部位EPCs内铁离子对PWI扫描序列的影响而无法重建CBV图,其余三组模型颅内胶质瘤与对侧正常脑白质相比均显示为高灌注,肿瘤实质区的rCBV值随瘤龄的增长有增大的趋势,各组4个检测时间点之间进行比较差异有显著统计学意义(P<0.01),但三组之间rCBV值差异不明显(P>0.05)。病理分析HE染色可见失去极性、排列紊乱的胶质瘤细胞,生长活跃的肿瘤细胞向正常脑组织浸润,呈“栅栏”样改变,瘤龄较长的肿瘤标本可以发现肿瘤中心的出血坏死灶。实验C组标本经普鲁士蓝染色后肿瘤组织内见大量蓝染细胞,主要集中在肿瘤内的血管区域。免疫组化CD34染色见肿瘤组织内丰富的形态不一、分布不均具有明显异质性的肿瘤微血管着色,对4组胶质瘤模型的MVD值进行比较,不同测量时间点4组模型大鼠颅内胶质瘤的MVD值无明显差异(P>0.05)。对照组、实验A组和实验C组的4个不同检测时间点的rCBV和MVD值均存在正相关。各组25d肿瘤组织微血管的直径范围在20.915um～26.143μm,4组之间的差异无统计学意义。VEGF染色后棕色或棕褐色颗粒主要定位于胞质内,计数各组胶质瘤模型不同时间点标本的阳性细胞,4组模型大鼠颅内胶质瘤表达VEGF的阳性细胞在不同测量时间点的差异并无统计学意义(P>0.05)。结论:1.采用SD大鼠脾脏获取单个核细胞,应用密度梯度离心结合贴壁筛选法可以较好地获得大鼠脾源性内皮祖细胞,体外培养可以获得较好的分化和增殖;体外EPCs可以通过细胞因子的旁分泌作用促进C6胶质瘤细胞的增殖能力,提高肿瘤细胞的侵袭力。2.P7228标记的EPCs能归巢至胶质瘤组织的血管区域,1.5 T MR可以显示标记的EPCs在胶质瘤组织内的聚集,提示其作为靶向MR标记物的可能性。3.基于本实验的研究结果,EPCs无论是通过细胞因子的旁分泌作用还是细胞间的直接接触诱导,在一定时间内还不足以改变C6胶质瘤的生长和侵袭等生物学行为,这可能与体内复杂的肿瘤微生态系统有关。