研究背景福尔马林固定石蜡包埋组织技术（Formalin-Fixed and Parrffin-Embedded,FFPE）广泛地应用于生物组织的保存,为生物学和医学检验提供了极大的便利。世界范围内FFPE样本储存量巨大,这也为基础生物学和临床医学研究提供了丰富的资源。随着精细蛋白质组技术的高度发展,FFPE样本的蛋白质组分析已成为实验室的常规手段之一。近年来生物体的空间基因表达水平分析逐渐成为新的研究热点。在空间蛋白质组研究中,人们把生物材料来源聚焦于FFPE样本,这是因为新鲜冷冻组织存在储存成本高、运输不便、蛋白质降解等缺点。然而,在FFPE切片上实现连续取样而且取样面积微小就会带来一系列蛋白质组分析技术的挑战。本项研究试图较为系统地评估微量FFPE蛋白质组分析所涉及到的技术环节,从而建立一个适合于日常操作的工作平台。研究目的建立一个微量FFPE蛋白质组分析流程,它具备操作简易、肽段提取效率高、整体实验耗时短、蛋白质鉴定达到世界先进水平等特点。研究方法本研究从三个层次上开展方法研究:1)优化传统FFPE蛋白质组样本制备技术,聚焦于微量样本的转移、缓冲液选择、解交联温度和时间、胰蛋白酶解条件、质谱参数评价等方面。2)采用激光捕获显微切割技术（Laser capture microdissection,LCM）在FFPE切片上切割不同面积的样本,从鉴定灵敏度和样本收集率两个角度评价,优化后的制备方法是否适合处理不同面积样本中含有的蛋白质。3)运用本研究建立的方法具体分析小鼠脑组织的FFPE切片上空间连续切割的样本,开展空间相关的蛋白质组信息分析。研究结果1.本研究建立一个稳定的微量FFPE蛋白质组分析技术,它的特点在于:从LCM取样至质谱分析这一过程中,没有任何样本转移的环节,这样最大程度上避免了肽段的丢失;采用一个稳定缓冲体系贯穿全过程包括95℃解交联和胰蛋白酶消化,尽可能减少缓冲液对质谱鉴定的干扰;设定数据依赖性采集（DDA）进行二级质谱信号收集,保证了微量肽段鉴定的质量和数量。2.本研究采用LCM在FFPE切片上切割了四种不同的面积,0.01 mm~2、0.02 mm~2、0.05 mm~2、0.1 mm~2,利用已建立的微量FFPE蛋白质组技术鉴定了这些样本蛋白质,分别为1500,2000,2800,3700个蛋白质。同时,评估了徕卡激光显微切割（Laser microdissection,LMD）切片机上样本的收集率,发现其随样本样本面积的增大而提高,在样本面积达到0.1 mm~2时,收集率最高。以5个厚度10μm,面积0.1 mm~2的小鼠大脑皮层样本的蛋白质组数据为方法学重现性评估的基础,所定量蛋白质的CV集中在20%以下,说明微量FFPE蛋白质组方法稳定性是可以接受的。3.本研究使用LMD在小鼠大脑FFPE切片上横跨大脑皮层,胼胝,海马和脑室区域连续切割了24个样本（0.1 mm~2面积）。微量蛋白质组分析表明,来自同一区域的样本具有更高的相关性,这提示,本研究建立的方法在绘制组织空间分辨率蛋白质丰度图谱上有潜在用途。结论本研究建立了一种微量FFPE蛋白质组分析方法。该方法在0.01mm~2面积的FFPE样本中可鉴定约1500个蛋白质,达到了目前微量FFPE蛋白质鉴定的先进水平;而且,该方法能够在0.1mm~2面积上得到稳定的蛋白质鉴定率,具有应用于空间蛋白质组分析的潜能。