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目的:从诱生IFN-α/β的TLR7/8-MyD88信号通路角度探讨麻黄先煎之麻杏石甘汤(简称MXSGD,下同)抗A型流感病毒的效应机理,为其临床应用提供理论支持。方法:1.A型流感病毒感染对TLR7/8介导的IFN-α/β分泌水平的影响与麻黄先煎之MXSGD含药血清的调控作用:(1)采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测不同煎煮方式的MXSGD(四药同煎、麻黄先煎20min、25min、30min)大鼠含药血清、对照药物(奥司他韦、抗病毒颗粒)大鼠含药血清对小鼠巨噬细胞(RAW264.7)干预12h、24h、48h的最大无毒浓度范围。(2)以不同浓度(高、中、低)之TLR7/8激活剂(R848)和TLR7/8抑制剂(抗体TLR7和抗体TLR8)干预小鼠巨噬细胞为对照,以酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)法检测高、中、低浓度的A型流感病毒稀释液干预小鼠巨噬细胞24h和48h后细胞上清液IFN-α/β的含量水平,筛选实验用A型流感病毒液的最佳浓度;(3)以ELISA法检测各大鼠含药血清干预对A型流感病毒稀释液感染小鼠巨噬细胞24h和48h后得上清液IFN-α/β的含量水平,以明确A型流感病毒感染对TLR7/8介导的IFN-α/β分泌水平的影响与麻黄先煎之MXSGD含药血清的调控作用。2.麻黄先煎之MXSGD含药血清对A型流感病毒感染细胞诱生IFN-α/β的TLR7/8-MyD88信号通路主要靶点基因与蛋白表达水平的影响:以实时荧光定量(Quantitative Real-Time PCR,q RT-PCR)及蛋白质印迹(Western Blot,WB)法分别检测各大鼠含药血清对适宜浓度的A型流感病毒液感染小鼠巨噬细胞24h和48h后的TLR7、TLR8、MyD88、IFN-α、IFN-β基因与蛋白表达水平,通过比较分析明确麻黄先煎之麻杏石甘汤对A型流感病毒感染细胞诱生IFN-α/β的TLR7/8-MyD88信号通路主要靶点基因表达水平的影响。3.麻黄先煎之MXSGD体内抗流感病毒效应机制研究:SPF级KM小鼠经鼻腔接种A型流感病毒小鼠肺适应株(A/PR/8/34)建立动物感染模型,经灌胃给药(奥司他韦、抗病毒颗粒、四药同煎及麻黄先煎之MXSGD)或给予生理盐水7天,通过检测各组肺组织TLR7、TLR8、MyD88蛋白的表达水平,并分析其与体重、肺指数的相关性,明确麻黄先煎之MXSGD体内抗流感病毒效应机制。结果:1.A型流感病毒感染对TLR7/8介导的IFN-α/β分泌水平的影响与麻黄先煎之麻杏石甘汤含药血清的调控作用:(1)12h、24h、48h MTT均显示:与12.5%浓度的胎牛血清组比较,浓度为50%、25%、12.5%、6.25%的大鼠空白血清没有毒性;与相应浓度的胎牛血清及大鼠空白血清对照组比较,浓度为50%、25%、12.5%、6.25%的大鼠含药血清对RAW264.7细胞没有毒性作用。(2)ELISA法检测结果显示:与胎牛血清对照组、空白大鼠血清组比较,激活剂R848组、病毒干预组细胞IFN-α/β分泌水平升高(P<0.05);与病毒干预组比较,MXSGD含药血清组细胞上清液的IFN-α/β显著降低(P<0.05);在含药血清作用48h时间点,与四药同煎MXSGD组比较,麻黄先煎25min之MXSGD细胞上清液中IFN-α含量显著降低(P<0.05)。2.麻黄先煎之麻杏石甘汤含药血清对A型流感病毒感染细胞诱生IFN-α/β的TLR7/8-MyD88信号通路主要指标基因与蛋白表达水平的影响:(1)q RT-PCR法检测结果显示:与胎牛血清对照组、空白大鼠血清组比较,激活剂R848组、病毒干预组细胞内TLR7、TLR8、MyD88、IFN-α、IFN-βm RNA表达显著上升(P<0.05);与病毒干预组比较,MXSGD含药血清组细胞内TLR7、TLR8、MyD88、IFN-α、IFN-βm RNA表达显著降低(P<0.05),与四药同煎MXSGD组比较,麻黄先煎之MXSGD组的TLR7、TLR8、MyD88、IFN-α、IFN-βm RNA表达水平显著性降低(P<0.05),麻黄先煎25min之MXSGD组的TLR7、TLR8、IFN-βm RNA表达水平显著性降低(P<0.05)。在含药血清作用48h时间点,与四药同煎MXSGD组比较,麻黄先煎20min、25min之MXSGD组的MyD88 m RNA表达水平显著性降低(P<0.05)。(2)Western Blot法检测结果显示:与胎牛血清对照组、空白大鼠血清组比较,激活剂R848组、病毒干预组细胞内TLR7、TLR8、MyD88、IFN-α、IFN-β蛋白表达显著上升(P<0.05);与病毒干预组比较,MXSGD含药血清组细胞内TLR7、TLR8、MyD88、IFN-α、IFN-β蛋白表达显著降低(P<0.05);在含药血清作用24h、48h时间点,与四药同煎MXSGD组比较,麻黄先煎之MXSGD组细胞内TLR7、TLR8、MyD88、IFN-α、IFN-β蛋白表达无显著性差异(P>0.05)。3.麻黄先煎之麻杏石甘汤体内对A型流感病毒感染小鼠的抗病毒效应研究:(1)麻黄先煎之麻杏石甘汤对流感病毒感染小鼠体重的影响:与正常对照组相比,模型对照组体重显著降低(P<0.05);与模型对照组相比,MXSGD同煎组、MXSGD先煎组小鼠体重显著增加(P<0.05);与MXSGD同煎组比较,MXSGD先煎组小鼠体重显著增加(P<0.05);MXSGD同煎治疗组、MXSGD先煎治疗组体重下降抑制率分别为29.57%、37.68%。(2)麻黄先煎之麻杏石甘汤对流感病毒感染小鼠肺指数的影响:与正常对照组相比,模型对照组肺指数显著升高(P<0.05);与模型对照组相比,MXSGD同煎组、MXSGD先煎组小鼠肺指数显著降低(P<0.05);与MXSGD同煎组比较,MXSGD先煎组小鼠肺指数显著降低(P<0.05);MXSGD同煎组、MXSGD先煎组对肺指数升高的抑制率分别为39.79%、45.60%。(3)Western Blot法检测结果显示:与正常对照组比较,流感病毒感染小鼠肺组织中TLR7、TLR8、MyD88的蛋白表达水平显著升高(P<0.05);与模型组比较,经药物干预后的各组肺组织中TLR7、TLR8、MyD88的蛋白表达水平不同程度下降(P<0.05);与MXSGD同煎组比较,MXSGD先煎组肺组织中TLR7、TLR8、MyD88的蛋白表达水平显著下降(P<0.05)。(4)感染造模并干预7天后的抗病毒效应指标(肺指数和体重)与(TLR7、TLR8、MyD88)蛋白表达量的Pearson积差相关分析结果显示:体重与TLR7蛋白表达呈负相关(r=-0.841,P<0.05);体重与TLR8蛋白表达呈负相关(r=-0.898,P<0.05);体重与MyD88蛋白表达呈负相关(r=-0.823,P<0.05);肺指数与TLR7蛋白表达呈正相关(r=0.899,P<0.05);肺指数与TLR8蛋白表达呈正相关(r=0.917,P<0.05);肺指数与MyD88蛋白表达呈正相关(r=0.763,P<0.05)。结论:1.MXSGD能对A型流感病毒感染小鼠巨噬细胞细胞上清液中的IFN-α、IFN-β有较明显的调节作用;在含药血清作用48h时间点,麻黄先煎25min之MXSGD含药血清对IFN-α含量水平的下调作用优于四药同煎之MXSGD含药血清。2.MXSGD对A型流感病毒感染小鼠巨噬细胞TLRs信号通路TLRs信号通路的主要基因(TLR7、TLR8、MyD88、IFN-α、IFN-βm RNA)及主要蛋白(TLR7、TLR8、MyD88、IFN-α、IFN-β蛋白)表达有较明显的调节作用。在部分作用时间点上,麻黄先煎某些时间点的MXSGD含药血清对该通路中某些基因的表达优于四药同煎之MXSGD含药血清。3.MXSGD对A型流感病毒感染小鼠有一定的保护作用,能抑制流感病毒感染所致的体重下降,降低肺指数;麻黄先煎之MXSGD的调控作用优于四药同煎之MXSGD。4.MXSGD对A型流感病毒感染小鼠肺组织中TLRs信号通路的TLR7、TLR8、MyD88蛋白表达具有较明显的调节作用,麻黄先煎之MXSGD的调控作用优于四药同煎之MXSGD。5.抗流感病毒的效应指标(肺指数和体重)和免疫学效应指标(MyD88、TLR7、TLR8蛋白的表达)之间存在一定的相关性。综上,MXSGD能通过调控诱生IFN-α/β的TLR7/8-MyD88信号通路对A型流感病毒感染模型的发挥抗病毒效应,在一定程度上通过“内调”、“外抗”实现中医学在防治流感上的“扶正”与“祛邪”。在部分时间作用点,麻黄先煎之MXSGD调节作用优于四药同煎之MXSGD。