【摘 要】
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目的耐碳青霉烯类药物的肺炎克雷伯菌（carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae,CRKP）是当前引发院内感染的重要病原菌之一,其普遍的耐药性和传播迅速的特点也是临床治疗的一大挑战。替加环素与多粘菌素B是治疗CRKP的主要手段,但在临床治疗过程中也发现耐药性的增高。异质性耐药是一类特殊表型,由于在临床无法通过常规手段检测,异质性耐药成为了当前引起抗生素临床治
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目的耐碳青霉烯类药物的肺炎克雷伯菌（carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae,CRKP）是当前引发院内感染的重要病原菌之一,其普遍的耐药性和传播迅速的特点也是临床治疗的一大挑战。替加环素与多粘菌素B是治疗CRKP的主要手段,但在临床治疗过程中也发现耐药性的增高。异质性耐药是一类特殊表型,由于在临床无法通过常规手段检测,异质性耐药成为了当前引起抗生素临床治疗失败的主要原因之一。本课题旨在研究多粘菌素B和替加环素异质性耐药的CRKP分离株的耐药机制并探讨联合用药的治疗效果。方法1.收集碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌临床分离株,PCR检测耐药相关基因存在情况。使用微量肉汤稀释法筛选多粘菌素B（polymyxin B,PMB）以及替加环素（tigecycline,TGC）敏感株,通过细菌种群分析确认多粘菌素B和替加环素异质性耐药情况。子代菌株通过微量肉汤稀释法确认最小抑菌浓度（minimal inhibitory concentration,MIC）,并通过连续传代观察稳定性情况。脉冲场凝胶电泳（pulsed-field gel electrophoresis,PFGE）检测异质性耐药菌株亲代和子代同源性情况。2.外排泵抑制剂羰基氰化氯苯腙（CCCP,Cyanide 3-chlorophenylhydrazone）行微量肉汤稀释法,测定替加环素MIC值。Real-Time PCR检测双组分系统（pmr A、pmr B、pho P和pho Q）和外排泵基因（acrA、acrB、tol C、oqx A和oqx B）表达水平的情况。3.时间杀菌曲线（Time-kill）用于分析多粘菌素B与替加环素单一用药以及联合用药对异质性耐药KP的治疗效果。结果1.95株CRKP临床分离株中,共检出90株（90/95,94.7%）多粘菌素B异质性耐药株,50株（50/95,52.6%）替加环素异质性耐药菌株,同时对两类药物存在异质性耐药现象的菌株46株（46/95,48.4%）。多粘菌素B异质性耐药频率为4.41×10-7到3.66×10-6,替加环素异质性耐药频率为2.14×10-6到5.12×10-6。PCR发现所有菌株（95/95,100%）均携带bla KPC,17株（17/95,17.9%）携带bla CTX-M-1,1株（1/95,1.1%）同时携带有bla KPC和bla NDM。经PFGE分析,证实亲代与子代同源。通过观察2株双异质性耐药子代株对多粘菌素B及替加环素MIC值,结果提示双异质性耐药菌株的多粘菌素B和替加环素耐药机制各自独立。2.在外排泵抑制实验中,2株存在替加环素异质性耐药的子代株KP230与KP250,在加入CCCP后MIC值分别出现8倍及16倍减小。Real-time PCR结果显示,替加环素异质性耐药子代株的外排泵基因acrA、acrB、tol C较亲代菌株出现不同程度表达水平的上调,分别是2.4-3.2倍（P<0.05）、3.0-5.7倍（P<0.05）及2.5-3.6倍（P<0.05）;多粘菌素B异质性耐药的子代菌株中,pmr A、pmr B表达水平高于亲代菌株,分别为3.2-214.6倍（P<0.05）及13.2-407.3倍（P<0.05）。3.时间-杀菌曲线显示,单一使用多粘菌素B或替加环素对异质性耐药菌株进行治疗的效果不佳。尽管在较高浓度（2×MIC）下,单药治疗组出现短暂杀菌效果,但在10h之后细菌重新生长。两药联合后,在较低浓度下（PMB 0.125mg/L+TGC 1mg/L）即能达到完全清除细菌的效果,并将杀菌效果持续至48h。结论在CRKP临床分离株中筛选出近半数同时对多粘菌素B和替加环素异质性耐药的菌株。双重异质性耐药菌株中,外排泵基因acrA、acrB、tol C及双组分系统pmr A、pmr B、pho P、pho Q表达水平高于亲代菌株,提示异质性耐药可能与双组分系统（Pmr AB和Pho PQ）以及外排泵系统（Acr AB-Tol C）相关。时间-杀菌曲线提示替加环素或多粘菌素B单用对异质性耐药菌株治疗的效果不佳,两药联合后,在早期即可达到完全清除细菌的效果。本研究对替加环素和多粘菌素B双重异质性耐药CRKP的机制以及联合用药效果进行了探讨,为临床针对异质性耐药菌株治疗提供了思路。
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